本发明专利技术公开了一种控制氧化铁纳米粒子在动物脑内分布及其荧光检测方法。本发明专利技术的目的是提供一种将链霉亲和素(SA)修饰的氧化铁纳米粒子分布于事先注入生物素的动物脑细胞膜表面的方法。将荧光素FITC结合的SA修饰在氧化铁纳米粒子表面标记氧化铁纳米粒子使其在相应激发光下呈绿色荧光，用AVV‑DIO‑ChR2‑mCherry特异性转染多巴胺能神经元使其在相应激发光下呈红色荧光。利用激光共聚焦显微镜的明场像及荧光成像观察到氧化铁纳米粒子在细胞膜上的分布。本发明专利技术通过简单地向黑质提供微量生物素的方法，使SA修饰的纳米粒子附着在细胞膜上的量明显增加，并用荧光成像方法检测了纳米粒子在体内附着于细胞膜上。
A Fluorescence Detection Method for Controlling the Distribution of Iron Oxide Nanoparticles in Animal Brain
【技术实现步骤摘要】
一种控制氧化铁纳米粒子在动物脑内分布及其荧光检测方法
本专利技术涉及纳米材料在动物体内分布的控制及检测表征，特别是控制氧化铁纳米粒子在动物脑内分布及其荧光检测方法，属于生物纳米材料及应用领域。
技术介绍
注入动物脑内的磁性氧化铁纳米粒子能否大部分地分布于细胞膜附近，对于在外磁场中触发神经元细胞膜通道具有关键的影响。多巴胺能神经元上的辣椒素受体TRPV1非选择性阳离子通道的触发，可以诱导钙离子内流，达到促进多巴胺分泌的目的，可用于治疗多巴胺缺乏引起的退行性神经疾病。利用链霉亲和素(SA)与生物素(biotin)之间的特异性结合，事先在动物脑内特定部位注射微量的biotin，biotin是生物膜合成所需的成分，因而容易吸附于细胞膜上，再将SA修饰的氧化铁纳米粒子注入到动物脑内同一区域，利用SA与biotin之间的强结合作用，可以控制氧化铁纳米粒子大部分分布于动物脑内神经元细胞膜上。在动物脑内微量注射的磁性氧化铁纳米粒子由于在组织内分布广且粒径小，使TEM观察组织内纳米粒子在亚细胞结构的分布时变得困难，可以用荧光标记技术观察纳米粒子在黑质内的分布情况。异硫氰酸荧光素(FITC)作为一种显绿色的荧光探针，可以与蛋白质中的氨基(-NH2)以及硫醇(-SH)基团共价结合。FITC最大吸收峰约480nm，最大荧光发射峰为520nm，这种荧光团的吸收及发射波长即使FITC与蛋白质结合后也没有明显的变化。因此将FITC-SA以化学交联的方式偶联在聚乙烯亚胺(PEI)修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子(PEI-SPIONs)表面，用来标记纳米粒子使其呈绿色荧光。腺相关病毒(AAV)属于无包膜的单链DNA病毒，只有在与腺病毒或疱疹病毒等辅助性病毒的共同参与下，宿主才能产生有致病性的AAV。因AAV不参与任何疾病的发生，转染力很强，表达周期长以及具有组织特异性等特点而被广泛应用。以脑立体定位注射的方式在DAT-Cre转基因动物黑质内注射腺相关病毒AVV-DIO-ChR2-mCherry，这种腺相关病毒顺向转染神经元，可特异性转染多巴胺能神经元，而对其他细胞比如胶质细胞等不具备转染性，并表达光激活蛋白ChR2，使细胞在特定频段的激光激发下产生动作电位。由于ChR2-mCherry融合蛋白的读码框是反向的，其两侧各有一对反向的lox位点(loxP和1ox2272)。通过带有基因Cre的腺相关病毒去转染细胞，使细胞的基因片段上带有Cre酶系，细胞能够表达Cre蛋白，然后Cre会通过识别基因ChR2-mCherry两对反向lox位点中的任意一对并使这对lox位点之间的序列倒置，最终细胞内表达ChR2-mCherry蛋白，使多巴胺能神经元显红色荧光。使用DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐)溶液对细胞核进行染色。由于DAPI可以透过完整的细胞膜，与细胞核内的DNA结合后显示蓝色荧光，因此可以用于活细胞和固定细胞的染色，以便结合ChR2-mCherry蛋白标记的多巴胺能神经元(显红色荧光)来判断氧化铁纳米粒子(氧化铁纳米粒子表面修饰层含FITC，显绿色荧光)是处于胞内还是胞外。本专利技术提供一种控制氧化铁纳米粒子在动物脑内分布及其荧光检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种将链霉亲和素修饰的氧化铁纳米粒子分布于事先注入生物素的动物脑组织中的细胞膜表面的方法，及用荧光标记检测氧化铁纳米粒子分布于细胞膜上的方法。以下实施例用小鼠作为模拟实验。具体步骤为：(1)将15g聚乙二醇(PEG)和0.3gPEI加入50mL三口烧瓶中，以乙酰丙酮铁(Fe(acac)3)为铁源，将回流时间和温度分别设置为1h和200-320℃，反应结束后使用甲苯、丙酮清洗，清洗完毕后分散在去离子水中，并使用LS磁珠分选柱滤去残留的聚合物以及甲苯、丙酮。得到聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米粒子(PEI-SPIONs)。(2)将13.2mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10.0mgN-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐溶于2mL0.01M的PBS缓冲液(pH＝7.4)中，然后加入40-120μLFITC-SA(1mg/mL)。避光环境下活化10min，随后加入2-3μLβ-巯基乙醇以避免蛋白质交联。然后将2mLPEI-SPIONs(2mg/mL)加入混合液中，在摇床内(100r/min，25℃)反应3h。使用LS磁珠分选柱除去游离的FITC-SA，用0.01MPBS缓冲液彻底洗涤，重复三次，可得到FITC-SA/PEI-SPIONs，将其置于4℃冷藏柜中保存。(3)荧光转染多巴胺能神经元：取8周龄以上的DAT-Cre转基因小鼠，通过腹腔注射适量的戊巴比妥钠溶液(80mg/kg)将其麻醉，使用剪刀将小鼠头部的毛发剪去，将头皮充分暴露出来，然后将小鼠头部固定在立体定位仪上。使用手术剪沿着矢状缝剪开头皮，分离上皮组织，并使用缝合线拉住上皮保持切口张开，露出颅骨，使用含75％酒精的棉球轻轻擦拭颅骨表面，进行消毒。P-97电极内灌满矿物油，彻底排出电极内气泡，使用Nanoliter2000系统作为压力注射设备将P-97电极置于电极夹持器上，排出一定量的矿物油，然后吸取适量的AVV-DIO-ChR2-mCherry，同时固定在脑立体定位注射仪上。AVV-DIO-ChR2-mCherry为能够特异性感染并使多巴胺能神经元呈红色荧光的腺相关病毒。调整脑立体定位注射仪高度和水平位置，保证前囱(Bregma)和后囱(Lambda)两点位于同一水平面上。以Bregma点作为零点，调节位置坐标至：AP：2.9mm，ML：±1.3mm，缓慢下降电极到达颅骨表面，并对电极下方的颅骨位置进行标记。然后上抬电极，在标记的位置处进行钻孔，露出硬脑膜，用注射器针尖挑破硬脑膜，暴露出脑结构，切勿触伤脑组织。将P-97电极调节至脑组织上方，根据深度坐标D-V：4.5mm缓缓下降电极，以每次50nL的量向黑质部位注射腺相关病毒，每点注射总量为150-300nL。病毒注射完成后，停留5～10min后再将电极缓慢抬出，防止压力过大使病毒溢出，以保证病毒能够更好的扩散。腺相关病毒注射完成后，使用手术缝合线将小鼠头部皮肤缝好，缝合处涂抹四环素软膏防止伤口感染。单笼单只并供水供食饲养2周以上。(4)生物素定位注射：确定小鼠前/后囱的位置，调整前/后囱的高度，使其务必始终处在同一条水平线上。参照小鼠立体定位图谱，确定小鼠左侧黑质坐标，即前囟(P后):-2.9mm，旁开(R右):1.3mm，深度(H):-4.5mm。在前囱后2.9mm以及矢状缝右侧1.3mm处的位置钻孔，孔径约2mm。通过P-97电极吸取200-400nL浓度为1mg/mL溶解在人工脑脊液(ACSF)中的生物素，将电极缓缓插入黑质坐标位置，以每次注入50nL的生物素溶液于黑质内，注射后留针10min。慢慢退针，并用手术缝合线将伤口缝合，并使用四环素软膏涂抹伤口以防止伤口感染，将小鼠挪至37℃左右的环境下，使其尽快回复正常；(4)纳米粒子定位注射：注射生物素24h之后，参照步骤(2)立体定位方法，使用P-97电极抽取500nL浓度为1mg/mL的FITC-SA/PEI-SPIONs分散液(分散液为pH＝7.2、浓度0.01M的PBS，并提前用本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种控制氧化铁纳米粒子在动物脑内分布及其荧光检测方法，其特征在于具体步骤为：(1)将15g聚乙二醇(PEG)和0.3g聚乙烯亚胺(PEI)加入50mL三口烧瓶中，以乙酰丙酮铁(Fe(acac)3)为铁源，将回流时间和温度分别设置为1h和200‑320℃，反应结束后先使用甲苯再使用丙酮依次清洗，清洗完毕后分散在去离子水中，并使用LS磁珠分选柱滤去残留的聚合物以及甲苯、丙酮，得到聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米粒子(PEI‑SPIONs)；(2)将13.2mg1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10.0mg N‑羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐溶于2mL 0.01M PH为7.2～7.4的PBS缓冲液中，然后加入浓度为1mg/mL的40μL‑120μL FITC‑SA，避光环境下活化10min，随后加入2μLβ‑巯基乙醇以避免蛋白质交联，然后将混合液加入浓度为2mg/mL的2mL的PEI‑SPIONs中，在摇床内，在转速100r/min，温度25℃反应3h，使用LS磁珠分选柱除去游离的FITC‑SA，用0.01M PBS缓冲液彻底洗涤，重复三次，可得到FITC‑SA/PEI‑SPIONs，将其置于4℃冷藏柜中保存待使用；(3)将AVV‑DIO‑ChR2‑mCherry借助立体定位仪注入小鼠黑质，注射总量为150‑300nL，特异性转染多巴胺能神经元使其在相应激发光下呈红色荧光；(4)将200‑400nL浓度为1mg/mL溶解在人工脑脊液(ACSF)中的生物素，借助立体定位仪将电极缓缓插入黑质坐标位置；(5)注射生物素24h之后，将500nL的分散于pH为7.2～7.4、浓度0.01M的PBS中浓度为1mg/mL的FITC‑SA/PEI‑SPIONs的分散液，借助立体定位仪将电极缓缓插入大鼠左侧黑质部位。...
【技术特征摘要】
1.一种控制氧化铁纳米粒子在动物脑内分布及其荧光检测方法，其特征在于具体步骤为：(1)将15g聚乙二醇(PEG)和0.3g聚乙烯亚胺(PEI)加入50mL三口烧瓶中，以乙酰丙酮铁(Fe(acac)3)为铁源，将回流时间和温度分别设置为1h和200-320℃，反应结束后先使用甲苯再使用丙酮依次清洗，清洗完毕后分散在去离子水中，并使用LS磁珠分选柱滤去残留的聚合物以及甲苯、丙酮，得到聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米粒子(PEI-SPIONs)；(2)将13.2mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10.0mgN-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐溶于2mL0.01MPH为7.2～7.4的PBS缓冲液中，然后加入浓度为1mg/mL的40μL-120μLFITC-SA，避光环境下活化10min，随后加入2μLβ-巯基乙醇以避免蛋白质交联，然后将混合液加入浓度为2mg/mL的2mL的PEI-SPIONs中，在摇...
【专利技术属性】
技术研发人员：张宝林，韩栋，苏礼超，韩贵华，
申请(专利权)人：桂林理工大学，
类型：发明
国别省市：广西,45
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