本发明专利技术提供一种能够容易进行定量测定的生物体物质的检测方法。一种检测方法，其为试样中的生物体物质的检测方法，其包含：向所述试样中混合使可结合生物体物质的蛋白质(A)与化学发光蛋白质(B)融合成的融合蛋白(C)、及所述化学发光蛋白质(B)的底物；以及，观察来自所述试样的发光信号，所述蛋白质(A)与所述蛋白质(B)以可进行共振能量转移的方式连接，所述蛋白质(A)为在结合有所述生物体物质的状态下可发出荧光的蛋白质(A1)、或可结合作为自体荧光分子的生物体物质的蛋白质(A2)，所述蛋白质(B)可以利用其发光能量激发所述蛋白质(A)的荧光或自体荧光。
Detection methods of biological substances and chemiluminescent indicators used in this method
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生物体物质的检测方法、该方法中使用的化学发光指示剂
本公开涉及一种生物体物质的检测方法、及该方法中使用的化学发光指示剂。
技术介绍
作为检测试样中的生物体物质的方法，可举出使用荧光蛋白的方法。例如，专利文献1提出了如下方案：使用结合作为生物体物质的非结合型胆红素则发挥荧光特性的UnaG蛋白或其变异体，来检测非结合型胆红素。胆红素是指作为血红蛋白的构成物的亚铁血红素的分解产物。胆红素有脂溶性的非结合型胆红素(也称为间接胆红素)和水溶性的结合型胆红素(也称为直接胆红素)。非结合型胆红素随着肝功能的降低而被排出至血液中或尿中。高浓度的间接胆红素引起核黄疸(胆红素脑病)。目前，胆红素的测定主要是以重氮法为代表的比色定量法。在血液检查时，通常测定总胆红素(直接胆红素和间接胆红素的合计)和直接胆红素，算出其差值，作为间接胆红素。现有技术文献专利文献专利文献1：WO2014/133158
技术实现思路
专利技术所要解决的技术问题使用UnaG那样的结合生物体物质的荧光蛋白进行该生物体物质的检测、定量的情况下，需要用于观测的激发光源。另外，由于为一波长激发一波长测光，因此，有时难以进行定量测定。因此，本公开在一方式中提供一种能够容易进行定量测定的生物体物质的检测方法及化学发光指示剂。用于解决问题的技术方案本公开在一个或多个实施方式中涉及一种检测方法，其为试样中的生物体物质的检测方法(以下，也称为本公开的检测方法。)，其包含：向所述试样中混合使可结合生物体物质的蛋白质(A)与化学发光蛋白质(B)融合成的融合蛋白(C)、及所述化学发光蛋白质(B)的底物；以及观察来自所述试样的发光信号，所述蛋白质(A)与所述蛋白质(B)以可进行共振能量转移的方式连接，所述蛋白质(A)为在结合有所述生物体物质的状态下可发出荧光的蛋白质(A1)、或可结合作为自体荧光分子的生物体物质的蛋白质(A2)，所述蛋白质(B)可以利用其发光能量激发所述蛋白质(A)的荧光或自体荧光。本公开在其它的一个或多个实施方式中涉及一种化学发光指示剂，其为含有使可结合生物体物质的蛋白质(A)与化学发光蛋白质(B)融合成的融合蛋白(C)的化学发光指示剂，其中，所述蛋白质(A)与所述蛋白质(B)以可进行共振能量转移的方式连接，所述蛋白质(A)为在结合有所述生物体物质的状态下可发出荧光的蛋白质(A1)、或可结合作为自体荧光分子的生物体物质的蛋白质(A2)，所述蛋白质(B)可以利用其发光能量激发所述蛋白质(A)的荧光或自体荧光。本公开在其它的一个或多个实施方式中涉及一种载体或转化体，其可表达融合蛋白(C)。本公开在其它的一个或多个实施方式中涉及一种判别方法，其包含：基于用本公开的检测方法得到的发光信号数据，判别试样中的生物体物质浓度。专利技术效果根据本公开，在一方式中，可以提供一种能够容易进行定量测定的生物体物质的检测方法。附图说明图1表示进行了C末端/N末端缺损变异的各种各样的UnaG与NLuc的融合蛋白的化学发光光谱。UnaG(CΔ0)+NLuc(NΔ1)表示最大的FRET效率。图2表示在接头序列中插入各种各样的变异时的化学发光光谱。与野生型化学发光胆红素指示剂的序列(GT)相比，置换为DD序列的变异体显示最大的FRET效率变化。图3表示野生型化学发光胆红素指示剂的滴定曲线。将3次独立测量的平均值进行标绘，利用希尔公式进行拟合。Kd值为3.05nM。图4表示相对于在室温下保存的冷冻干燥试样的胆红素的亲和性(解离常数、Kd值)的变化。图5表示用智能手机拍摄的野生型化学发光胆红素指示剂和各种各样的浓度的胆红素溶液的96孔板上的化学发光像。图6表示实施例2中的利用UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合蛋白的胆红素测定的结果的一例，图6的A表示化学发光光谱，图6的B是表示UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合蛋白溶液(检测试剂)的稀释率和由发光强度得到的峰值的比率值(530nm/460nm)的关系的坐标图。图7表示比较例1中的利用UnaG蛋白的胆红素测定的结果的一例，图7的A表示荧光光谱，图7的B是表示UnaG蛋白溶液(检测试剂)的浓度和峰值(530nm)的荧光强度的关系的坐标图。具体实施方式本公开基于如下见解：通过在当检测生物体物质时与该生物体物质结合而发出荧光的蛋白质上，以可引起共振能量转移的方式融合化学发光蛋白质，从而不使用用于观测的激发光源，另外，可以使用双波长的测定光，可以容易地进行该生物体物质的定量。本公开的检测方法在一个或多个实施方式中包含：将使可结合生物体物质的蛋白质(A)与化学发光蛋白质(B)融合成的融合蛋白(C)作为化学发光指示剂使用，检测试样中的生物体物质。[生物体物质及试样]作为本公开的检测方法的检测对象，可举出生物体试样中的生物体物质。作为生物体试样，为含有源自生物的该生物体物质的试样，优选为液体状。作为这样的生物体试样，没有特别限制，可举出例如：全血、血清、血浆、及尿等体液试样。另外，本专利技术中的生物体试样可以根据需要进行稀释和/或前处理等。本公开的检测方法当然可以将上述“生物体试样”以外的试样设为测定对象。可举出例如检测对象的生物体物质的标准试样、即用于测定的对照试样。作为生物体物质，为结合于后述的蛋白质(A)的物质，可举出例如：生物体内的低分子化合物、分解代谢物、核酸、糖、肽、蛋白质、细胞、或微生物等。[可结合生物体物质的蛋白质(A)]作为本公开的“可结合生物体物质的蛋白质(A)”，在一个或多个实施方式中，可举出：在结合有生物体物质的状态下可发出荧光的蛋白质(A1)、及可结合作为自体荧光分子的生物体物质的蛋白质(A2)。作为在结合有生物体物质的状态下可发出荧光的蛋白质(A1)，在一个或多个实施方式中，可举出在脱辅基蛋白时为无荧光性、结合作为配体的生物体物质而成为全蛋白时有荧光性的蛋白质。作为所述蛋白质(A1)的一个或多个实施方式，可举出UnaG蛋白。另外，作为所述蛋白质(A1)的其它的一个或多个实施方式，可举出smURFP、IFP、及iRFP。UnaG蛋白具有与间接胆红素特异性地结合、利用青色的激发光而发光成绿色的性质(Kumagaietal.,Cell2013,153,1602-1611)。UnaG与间接胆红素具有极高的结合能力(解离常数＝98pM)。UnaG的序列信息可以参照UniProtKB/Swiss-Prot：P0DM59.1、或GenBank：AB763906.1(2016年8月时刻)。如果使用UnaG蛋白作为所述蛋白质(A1)，则可以进行例如间接胆红素的检测。smURFP为smallultraredfluorescentprotein(小超红蛋白)的简称，为与作为血红蛋白的代谢物的胆绿素结合而显示红色的荧光性的蛋白质(Rodriguezetal.,NatureMethods,2016,13,763-769)。IFP为infrared-fluorescentprotein(红外荧光蛋白)的简称，为与胆绿素结合而显示红色的荧光性的蛋白质(ShuX,etal.,Science2009,324(5928),804-8-7)。iRFP为near-infraredfluorescentprotein(近红外荧光蛋白)的简称，为与胆绿素结合而本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测方法，其为试样中的生物体物质的检测方法，其包含：向所述试样中混合融合蛋白(C)、及化学发光蛋白质(B)的底物，所述融合蛋白(C)为使可结合生物体物质的蛋白质(A)与化学发光蛋白质(B)融合成的融合蛋白(C)；以及观察来自所述试样的发光信号，所述蛋白质(A)与所述蛋白质(B)以可进行共振能量转移的方式连接，所述蛋白质(A)为在结合有所述生物体物质的状态下可发出荧光的蛋白质(A1)、或可结合作为自体荧光分子的生物体物质的蛋白质(A2)，所述蛋白质(B)可以利用其发光能量激发所述蛋白质(A)的荧光或自体荧光。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.01.27 JP 2017-0134631.一种检测方法，其为试样中的生物体物质的检测方法，其包含：向所述试样中混合融合蛋白(C)、及化学发光蛋白质(B)的底物，所述融合蛋白(C)为使可结合生物体物质的蛋白质(A)与化学发光蛋白质(B)融合成的融合蛋白(C)；以及观察来自所述试样的发光信号，所述蛋白质(A)与所述蛋白质(B)以可进行共振能量转移的方式连接，所述蛋白质(A)为在结合有所述生物体物质的状态下可发出荧光的蛋白质(A1)、或可结合作为自体荧光分子的生物体物质的蛋白质(A2)，所述蛋白质(B)可以利用其发光能量激发所述蛋白质(A)的荧光或自体荧光。2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述蛋白质(A1)为在结合有胆红素的状态下可发出荧光的UnaG蛋白或其变异体，检测对象的生物体物质为胆红素。3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述蛋白质(A1)为在结合有胆绿素的状态下可发出荧光的、选自由IFP、iRFP、smURFP、及它们的变异体构成的组中的蛋白质，检测对象的生物体物质...
【专利技术属性】
技术研发人员：永井健治，新井由之，
申请(专利权)人：国立大学法人大阪大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP
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