植物生产口服重组人粒细胞集落刺激因子制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及植物生产口服重组人粒细胞集落刺激因子。本发明专利技术利用植物例如生菜作为重组蛋白质生产的有效表达平台，利用简单以及高效的表达体系生产生物活性物质。随后将生产该活性物质的叶片冻干制成胶囊。此胶囊可以在常温保存而保持生物活性。利用Western Blot蛋白杂交法确定降糖活性蛋白成功表达。生物活性测试结果表明利用该平台技术生产的重组人粒细胞集落刺激因子活性显著。

Plant production of oral recombinant human granulocyte colony stimulating factor

【技术实现步骤摘要】
植物生产口服重组人粒细胞集落刺激因子
本专利技术涉及生物
，特别涉及植物生产口服重组人粒细胞集落刺激因子。
技术介绍
人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是由单核细胞、纤维母细胞、内皮细胞产生的一种分子量约为20KD的糖蛋白类调节因子，其等电点约为6.0。G-CSF作用于骨髓中性粒细胞系造血前体细胞，促进其增殖、分化、成熟和释放。成熟人体内G-CSF有177个氨基酸(a)型和174个氨基酸(b)型两种异构体，b型分子的螺旋含量很高，晶体构型含有四个a螺旋，属于长链螺旋细胞因子家族。鉴于b型的生物学活性及稳定性均显著高于a型，b型分子深受研究者的推崇。重组人G-CSF已广泛用于骨髓移植和肿瘤的治疗，此外，重组人粒细胞集落刺激因子还被用于治疗急性白血病、再生障碍性贫血等疾病。G-CSF在辅助肿瘤治疗方面的作用主要是增加白细胞数目，降低化疗和放疗的风险。目前已有多种以b型为基础的重组人粒细胞制剂被批准上市，如非格司亭(filgrastim)，来格司亭(lenograstim)，那托司亭(nartograstim)。其中非格司亭和那托司亭为大肠杆菌表达的非糖基化形式的重组人G-CSF，而来格司亭是CH0细胞表达的带糖基化修饰的G-CSF。非格司亭氨基酸序列即在天然G-CSF的N端附加一个蛋氨酸，那托司亭为非格司亭的突变体，共涉及天然G-CSF中5个氨基酸的定点突变。目前已知的制备GM-CSF的方法主要有二种：(1)利用真核细胞来表达。例如用酵母细胞、用COS-1动物细胞来表达、用CHO细胞、或用昆虫细胞进行表达。利用真核细胞表达蛋白的最大优点是表达的蛋白可以部分或完全糖基化，因而更接近天然蛋白构型。但其缺点是表达量普遍较低，而生产成本很高、生产工艺复杂。(2)利用大肠杆菌制备GM-CSF。既然糖基化对GM-CSF的生物学活性并无意义，那么用大肠杆菌(E.coli)表达GM-CSF就十分合适。目前大部分重组GM-CSF均是来源于E.coli。大肠杆菌制备GM-CSF的优点是低成本和高表达。目前使用大肠杆菌制备GM-CSF时，均采用胞浆表达法，所表达的GM-CSF在大肠杆菌胞浆中以不溶性的包含体(inclusionbodies)形式存在。这种表达体系的缺点主要表现在以下两个方面：(a)在纯化过程中必须使用变性剂或去污剂，需要变性和复性的过程，这给下游的纯化工作带来困难，同时也降低了产品的最终得率；(b)这种表达体系更大的缺点是使表达的GM-CSF的N端比天然GM-CSF多了一个甲硫氨酸残基(Met)。因此在体内应用时可能会刺激机体产生抗体，从而影响疗效并加大了副作用。因此，提供一种方便高效地生产GM-CSF的方法具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供植物生产口服重组人粒细胞集落刺激因子的应用。本专利技术利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的高效平台技术，表达了重组人粒细胞集落刺激因子。并且制成口服重组人粒细胞集落刺激因子。本专利技术对具有降糖作用的活性多肽进行结构改造和修饰，使其获得可通过肠道进行吸收并在体内达到有效治疗浓度的特性，并通过植物来生产该活性物质。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了植物作为宿主生产重组人粒细胞集落刺激因子的应用；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。在上述研究的基础上，本专利技术提供了一种表达载体，包括重组人粒细胞集落刺激因子的核苷酸序列以及叶绿体表达载体。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述重组人粒细胞集落刺激因子的序列为将重组人粒细胞集落刺激因子的密码子优化为植物偏好的密码子，获得优化序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述优化序列如SEQIDNo.2所示；所述重组人粒细胞集落刺激因子的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。在本专利技术的一些具体实施方案中，其构建方法包括如下步骤：步骤1：将重组人粒细胞集落刺激因子的密码子优化为植物偏好的密码子，获得优化序列；步骤2：将步骤1获得的所述优化序列克隆到pUC57载体中，获得pUC57-CSF。本专利技术还提供了所述的表达载体在表达重组人粒细胞集落刺激因子中的应用。本专利技术还提供了一种植物作为宿主表达重组人粒细胞集落刺激因子的方法，将所述的表达载体用基因枪轰击叶片，在植物叶绿体中表达后获得再生植株，将植物叶片冻干粉碎，灌装胶囊，制成重组人粒细胞集落刺激因子。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述基因枪轰击包括如下步骤：步骤1：准备转化用载体步骤2：准备微粒子弹；步骤3：基因枪轰击；步骤4：转换后培养、再生为植株。本专利技术通过植物叶绿体表达技术是利用基因枪轰击、同源重组的方式将含有目标蛋白的质粒转移到植物叶绿体中，获得该基因植物叶绿体中高效表达的技术。与动物细胞表达系统相比，植物表达系统的成本非常低，仅为其千分之一到千分之二。本专利技术利用植物叶片，生产口服重组人粒细胞集落刺激因子。该降糖产品不需要注射，减轻病患的痛苦，同时这一产品为长效降糖产品，病患可以做到一周用药一次。生菜不含有植物有毒物质，而且本产品不需蛋白纯化流程，可以大大缩短生产周期和生产成本。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示载体pUC57-CSF示意图；图2示western-blot结果；图3示生菜表达G-CSF能显著改善MPTP诱导的小鼠行为异常。具体实施方式本专利技术公开了植物作为宿主在表达重组人粒细胞集落刺激因子的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术提供了植物作为宿主在表达重组人粒细胞集落刺激因子的应用。优选的，所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。本专利技术还提供了一种表达载体，包括重组人粒细胞集落刺激因子序列以及载体。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述重组人粒细胞集落刺激因子密码子优化为植物偏好的密码子。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述优化的重组人粒细胞集落刺激因子的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；所述优化的重组人粒细胞集落刺激因子的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述载体为植物叶绿体载体。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：步骤1：将重组人粒细胞集落刺激因子的密码子优化为植物偏好的密码子；步骤2：由金斯瑞进行基因合成克隆到pUC57载体中，获得pUC57-CSF克隆载体；具体的，为了提供外源蛋白在植物中的高效表达，本专利技术将重组人粒细胞集落刺激因子氨基酸序列利用反翻译软件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/st本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.植物作为宿主生产重组人粒细胞集落刺激因子的应用；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

【技术特征摘要】
1.植物作为宿主生产重组人粒细胞集落刺激因子的应用；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。2.一种表达载体，其特征在于，包括重组人粒细胞集落刺激因子的核苷酸序列以及叶绿体表达载体。3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述重组人粒细胞集落刺激因子的序列为将重组人粒细胞集落刺激因子的密码子优化为植物偏好的密码子，获得优化序列。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述优化序列如SEQIDNo.2所示；所述重组人粒细胞集落刺激因子的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。5.根据权利要求2至4任一项所述的表达载体，其特征在于，其构建方法包括如下步骤：步骤1：将重组人粒细胞集落刺激因子的密码子优化为植物偏好的密码子，获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：王跃驹，陈书元，张月恒，
申请(专利权)人：王跃驹，
类型：发明
国别省市：美国,US