一种酪氨酸酶抑制肽及其应用制造技术

本发明专利技术属于食品深加工技术领域，具体涉及一种提取自核桃粕的酪氨酸酶抑制肽及其制备方法与应用。所述酪氨酸酶抑制多肽FPY的氨基酸序列为Phe‑Pro‑Tyr，C端为Tyr，N端为Phe。本发明专利技术提供的FPY对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶均有抑制作用，其IC50分别为0.47±0.01mg/mL、1.37±0.03mg/mL；本发明专利技术提供的FPY在主要胃肠蛋白酶消化后，其对酪氨酸单酚酶及二酚酶的IC50值与消化前相比无明显差异；RP‑HPLC鉴定结果显示，FPY消化前后的保留时间、峰面积和峰高并无明显变化，表明酪氨酸酶抑制肽FPY具有良好的体外消化稳定性。

A tyrosinase inhibitory peptide and its application

【技术实现步骤摘要】
一种酪氨酸酶抑制肽及其应用
：本专利技术属于食品深加工
，具体涉及一种提取自核桃粕的酪氨酸酶抑制肽及其制备方法与应用。
技术介绍
：核桃(JuglansregiaL.)是市面上常见的坚果类作物之一，具有丰富的营养价值和药用功效。核桃榨油后产生大量的副产物核桃脱脂粕，通常以饲料低价出售，不仅造成核桃蛋白资源的浪费，也严重阻碍了核桃产业的发展。生物酶解技术作为一种绿色生物转化手段，一方面有助于提高底物的生物利用率，另一方面可以将核桃粕蛋白分解成更利于人体吸收的小分子化合物，增加功能活性，提高营养价值。生物活性肽是指亲本蛋白质片段在特定蛋白酶的作用下分解成小分子片段，可以调节机体代谢机制或具有特殊生物活性的一类物质的总称，通常每分子含有2-20个氨基酸残基，分子量小于6000Da。生物活性肽存在于牛奶、乳制品、植物、动物和微生物蛋白中，在胃肠消化或食品加工过程中大分子蛋白被分解释放小分子肽，作为调节化合物或类激素物质在生物体内发挥重要生理作用，近年来，已有广泛的科学研究表明生物活性肽对人类健康有益。有许多方法可以制备具有生物活性的多肽，最常见的方法是：生物酶解法、微生物发酵法、化学合成法及生物工程法。黑色素在色素细胞特有的膜性细胞器黑素小体内合成，其类型、含量及在周围角质形成细胞中的分布决定了人体皮肤的实际颜色，黑色素过度沉积将会引发皮肤病和一些其它疾病，如黄褐斑、黑色素瘤等。酪氨酸酶是一种含铜混合功能氧化酶，在哺乳动物大脑中发现酪氨酸酶活性与帕金森病和其它神经退行性疾病相关，在农产品加工与贮藏中与水果、蔬菜、菌类例如蘑菇的瘀伤或长期储存时发生的褐变有关。在黑色素合成过程中，酪氨酸酶催化L-酪氨酸氧化成L-多巴，随后将L-多巴氧化成L-多巴醌，再通过一系列非酶促过程转换为黑色素，前一步和后一步反应分别定义为单酚酶和二酚酶反应。因此，对于酪氨酸酶抑制剂的开发引起了医药、食品和化妆品领域极大的兴趣，而已知的酪氨酸酶抑制剂显示出高细胞毒性和不稳定性，并且缺乏控制其使用的安全规定，不能广泛用于医药、食品或化妆品行业中。因此，需要开发没有毒性和长期稳定性的新型抑制剂。目前，曲酸、熊果苷和对苯二酚是在化妆品领域应用较为广泛的酪氨酸酶抑制剂，虽然这些药物能够产生较强的治疗效果，但同时也具有严重的副作用。自20世纪60年代以来，曲酸和对苯二酚已成为市售美白产品中的活性成分，但可能具有遗传毒性和致癌作用，熊果苷是从小麦、梨皮和蓝莓叶中提取的糖基化氢醌，很容易在皮肤表面转化为有害的对苯二酚。因此，迫切需要开发安全稳定的黑色素抑制剂。
技术实现思路
：为了解决上述技术问题，本专利技术以冷榨核桃粕为原料，利用生物酶解法制备核桃多肽，并对多肽酶解过程的工具酶进行筛选，采用响应面法优化核桃粕蛋白酶解工艺。采用超滤、葡聚糖凝胶层析等方法分离纯化核桃粕蛋白酶解液，并测定酪氨酸单酚酶及二酚酶抑制率，筛选出酪氨酸酶抑制活性较高的多肽组分，对纯化后的核桃粕多肽进行液质分析，确定核桃粕多肽的氨基酸序列及分子量分布。利用AutodockVina进行分子对接确定目标多肽，人工合成目标多肽并对其进行酪氨酸酶抑制动力学研究和体外消化稳定性研究，最终获得一种性能优越的酪氨酸酶抑制多肽。本专利技术提供一种酪氨酸酶抑制多肽FPY，所述酪氨酸酶抑制多肽FPY的氨基酸序列为Phe-Pro-Tyr，C端为Tyr，N端为Phe。所述酪氨酸酶抑制多肽FPY相对分子量为498.23Da。FPY与酪氨酸酶的对接构象显示，三肽FPY主要对接在受体蛋白酪氨酸酶(2Y9X)的凹槽中，它们之间的相互作用主要有三类：氢键、疏水相互作用、静电相互作用。酶动力学研究结果显示，人工合成短肽FPY对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶均有抑制作用，其IC50分别为0.47±0.01mg/mL、1.37±0.03mg/mL。FPY对酪氨酸单酚酶的抑制作用类型为竞争性可逆抑制，米氏常数Km＝3.56mmol/L，抑制常数Ki＝22.04mmol/L，对酪氨酸二酚酶的抑制作用类型为竞争性可逆抑制，米氏常数Km＝4.09mmol/L，抑制常数Ki＝4.82mmol/L；且在体外胃肠蛋白酶作用下能保持良好的酪氨酸酶抑制活性。本专利技术还提供多肽FPY在酪氨酸酶抑制中的应用。有益效果：1.本专利技术提供的人工合成短肽FPY对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶均有抑制作用，且具有剂量依赖性，随着FPY浓度的增加，酪氨酸单酚酶和二酚酶抑制率迅速上升，其IC50分别为0.47±0.01mg/mL、1.37±0.03mg/mL。2.本专利技术提供的FPY对酪氨酸单酚酶及二酚酶的抑制类型，结果显示，随着FPY浓度的增加，Vmax值不变，而Km值增大，因此，FPY对酪氨酸酶单酚酶的抑制作用类型为竞争性可逆抑制，抑制常数Ki＝22.04mmol/L；FPY对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用类型为竞争性可逆抑制，抑制常数Ki＝4.82mmol/L。3.本专利技术提供的FPY在主要胃肠蛋白酶消化后，其对酪氨酸单酚酶及二酚酶的IC50值分别为0.48±0.02mg/mL、1.38±0.04mg/mL，与消化前相比无明显差异。RP-HPLC鉴定结果显示，FPY消化前后的保留时间、峰面积和峰高并无明显变化，表明酪氨酸酶抑制肽FPY具有良好的体外消化稳定性。附图说明：图10-3KDa分子量多肽的SephadexG-25层析色谱图；图2总离子流图；图3FPY的3D结构图；图4FPY质谱分析图；图5酪氨酸酶(2Y9X)的3D结构图；图6FPY与酪氨酸酶的相互作用；其中，A：立体图；B：平面图；图7FPY对酪氨酸酶活性的影响；图8不同浓度FPY对酪氨酸单酚酶的催化活性与酶浓度的关系；图9FPY对酪氨酸单酚酶的抑制类型和抑制常数的测定；图10不同浓度FPY对酪氨酸二酚酶的催化活性与酶浓度的关系；图11FPY对酪氨酸二酚酶的抑制类型和抑制常数的测定；图12消化前FPY反相高效液相色谱图；图13消化后FPY反相高效液相色谱图。具体实施方式：为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本专利技术。本专利技术所述的酪氨酸酶抑制多肽FPY可以从核桃粕中提取，也可通过人工合成的方法获取，以下将以从核桃粕中提取酪氨酸酶抑制多肽FPY以及人工合成多肽FPY验证酶学特性为例对本专利技术进行解释说明。实施例1酪氨酸酶抑制多肽FPY的提取1、核桃粕蛋白的制备核桃粕粉碎过40目筛，以1∶5的料液比加入石油醚抽提2h，过滤，收集残渣，连续提取3次，置于通风橱中挥干有机溶剂，即得核桃粕脱脂粉，于4℃条件下保存备用。准确称取10g核桃粕脱脂粉于400mL的烧杯中，加入200mL的蒸馏水，调节pH至10.0，在磁力搅拌器上搅拌5min，然后超声处理20min，超声结束后立即取出，静置1h，6000r/min离心20min，取上清液备用。用1mol/L的HCl调节pH至4.5，静置1h，6000r/min离心20min，得到核桃粕蛋白沉淀，用1mol/LNaOH调pH值至7.0，得到核桃粕蛋白，真空冷冻干燥备用。2、多肽的制备将制备的核桃粕蛋白冻干粉以1∶20的料液比(w/v)与蒸馏水混合，并在90℃条件下预煮3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酪氨酸酶抑制多肽FPY，其特征在于，所述酪氨酸酶抑制多肽FPY的氨基酸序列为Phe‑Pro‑Tyr，C端为Tyr，N端为Phe。

【技术特征摘要】
1.一种酪氨酸酶抑制多肽FPY，其特征在于，所述酪氨酸酶抑制多肽FPY的氨基酸序列为Phe-Pro-Tyr，C端为Tyr，N端为Phe。2.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：王慧林，王睿，苑朋举，王彦兵，
申请(专利权)人：河北黄金龙农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13