一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因及其编码的蛋白和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因及其编码的蛋白和应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术基因具有正调控水稻粒长和千粒重的功能，能应用于增加水稻千粒重和提高水稻产量。

A GLW 10 Gene Controlling Grain Length and 1000-Grain Weight in Rice and Its Encoding Protein and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因及其编码的蛋白和应用
本专利技术属于基因工程及遗传育种
，具体涉及一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因及其编码的蛋白和应用。
技术介绍
水稻是我国最重要的粮食作物之一，全国65％以上的人口以稻米为主食，稻米消费量极其巨大。水稻是我国第一大粮食作物，其种植面积、总产和单产均居粮食作物首位，在保障国家粮食安全中起着决定性作用。但近年来，随着我国人口持续增加、而农业劳动力数量不断减少、以及可耕地面积逐年减少、全球气候变暖等环境影响加剧，使我国水稻产业发展面临多方面挑战。因此，进一步提高水稻产量，对于确保我国粮食安全和农业可持续发展具有十分重要的战略意义。水稻产量属于复杂的农艺性状，由单株有效穗数、每穗粒数、结实率和千粒重组成，这些性状均是复杂的数量性状。千粒重作为水稻产量的直接组成因素之一，它是由粒型和籽粒充实度决定的。粒型主要包括粒长，粒宽以及粒厚3个方面。粒型不仅会影响水稻产量，而且还会影响水稻品质，尤其是其外观品质。因此挖掘粒型相关基因的遗传基础对水稻高产优质育种是十分必要的，目前已经有大量的粒型相关基因或者QTL位点被克隆，其中，粒长主效QTL位点包括：GS3、GL3.1、GS2、OsLG3、OsLG3b/LGY3、TGW3/GL3.3等；粒宽主效QTL位点包括：GW2、GS5、GW8、GW5/GSE5、GL7/GW7、OsOTUB1等。虽然目前已经报道不少粒型相关基因，但是对这些基因的调控机制研究仍然还只是片面化的，尤其是基因之间的互作关系，调控网络等还不清楚，迫切需要进一步挖掘粒型和千粒重相关基因。专利
技术实现思路
针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因及其编码的蛋白和应用，该基因具有正调控水稻粒长和千粒重的功能。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步地，该基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示的序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且能编码具有相同功能蛋白的核苷酸序列。上述GLW10基因编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。进一步地，该蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能的氨基酸序列。包含上述GLW10基因的质粒。包含上述GLW10基因的重组表达载体。包含上述GLW10基因的转基因细胞系。包含上述GLW10基因的工程菌。上述GLW10基因在改良水稻粒长和千粒重，提高水稻产量中的应用。本专利技术的有益效果为：本专利技术利用蜀恢498的EMS诱变小粒突变体glw10为研究材料，利用BSA混池测序，结合MutMap定位方法，定位到候选GLW10基因。利用CRISPR/Cas9系统编辑GLW10获得敲除转基因株系，敲除株系与野生型相比粒长显著降低，千粒重下降。而过量表达GLW10的转基因植株表现为粒长和千粒重显著增加，说明GLW10具有正调控水稻粒长和千粒重的功能，能应用于增加水稻千粒重和提高水稻产量。附图说明图1为GLW10基因敲除载体GLW10-BGK03结构示意图；图2为GLW10基因过量表达载体pCAMBIA2300-35S-GLW10-eGFP结构示意图；图3为GLW10基因敲除靶位点及敲除植株突变方式示意图；“.”表示该位置碱基缺失；图4为GLW10基因敲除株系粒型和千粒重考种数据；其中，“**”表示在0.01水平下差异显著；图5为GLW10基因敲除株系粒长和粒宽示意图；标尺为3mm；图6为GLW10基因过量表达转基因株系定量检测；其中，“**”表示在0.01水平下差异显著；图7为GLW10基因过量表达转基因株系粒型和千粒重考种数据；其中，“**”表示在0.01水平下差异显著；图8为GLW10基因过量表达转基因株系粒长和粒宽示意图，标尺为3mm。具体实施方式下面对本专利技术的具体实施方式进行描述，以便于本
的技术人员理解本专利技术，但应该清楚，本专利技术不限于具体实施方式的范围，对本
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本专利技术的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本专利技术构思的专利技术创造均在保护之列。本专利技术在蜀恢498的EMS(甲基磺酸乙酯)诱变突变体库中意外发现一个小粒突变体glw10，将glw10与野生型蜀恢498杂交构建F2分离定位群体，将群体中极端小粒单株进行BSA混池测序，利用MutMap定位方法，定位到候选GLW10基因；利用CRISPR/Cas9系统敲除GLW10，发现该基因在调控水稻粒长和千粒重方面的功能。实施例1GLW10的CRISPR/Cas9敲除载体构建本专利技术利用百格公司的CRISPR/Cas载体构建试剂盒构建GLW10的敲除载体，具体过程如下：(1)利用http://skl.scau.edu.cn/网站的targetDesign在线工具，设计敲除靶位点；在网站输入GLW10基因核苷酸序列(SEQIDNO.2)，生成19bp的gRNA靶点序列T1，该靶点序列如下：T1：5’-GGGTGCTTCCTGTCCAAGC-3’(SEQIDNO.3)(2)将以上靶点序列T1输入百格公司Oligo序列在线设计网站(http://121.41.105.238/index/excrispr)，选择BGK03载体，生成与试剂盒对应的Oligo序列，Oligo-F和Oligo-R序列如下：Oligo-F：5’-TGTGTGGGGTGCTTCCTGTCCAAGC-3’(SEQIDNO.4)Oligo-R：5’-AAACGCTTGGACAGGAAGCACCCCA-3’(SEQIDNO.5)由生工生物公司合成以上Oligo-F和Oligo-R序列，然后将合成的Oligo-F和Oligo-R引物加水溶解至10μM。(3)按照百格CRISPR/Cas载体构建试剂盒说明书进行如下操作：步骤1：制备Oligo二聚体配制PCR反应体系(18μLBufferAnneal，1μLOligo-F，1μLOligo-R)混匀后，用PCR仪按照如下反应程序进行：95℃加热3分钟，之后以0.2℃/秒的速度缓慢降至20℃，冷却复性之后即得到Oligo二聚体。步骤2：将以上Oligo二聚体构建至CRISPR/Cas载体在冰上配制反应体系(2μLCRISPR/CasVector、1μLOligo二聚体、1μLEnzymeMix，最后加水至10μL)混匀后，室温反应1小时。步骤3:将以上反应体系转化大肠杆菌将大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1(北京全式金生物技术有限公司)从-80℃中取出，置于冰水浴中融化；再加入步骤2制备得到的5μL反应体系，轻轻混匀，冰上孵育30分钟(不要晃动)；之后置于42℃金属浴，热激60秒后，立刻置于冰水浴中，静置2分钟；再向离心管中加入500μL无抗LB液体培养基，37℃金属浴复苏10分钟；之后置于摇床，200rpm、37℃振荡培养1小时，使菌体复苏；吸取适当体积菌液，用无菌涂布棒在含有卡那霉素抗性的LB平板上轻轻涂匀，37℃倒置培养过夜。步骤4：提取质粒，获得GLW10敲除载体GLW10-BGK本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示的序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且能编码具有相同功能蛋白的核苷酸序列。3.权利要求1或2所述GLW10基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。4.根据权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈薇兰，袁华，钦鹏，李仕贵，刘艺，邓朝杨，涂斌，王玉平，马炳田，陈郡雯，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51