一种转基因抗除草剂玉米事件的创制方法技术

本发明专利技术涉及一种转基因抗除草剂玉米事件的创制方法，所述转基因玉米事件的核酸序列包括SEQ ID NO：1或其互补序列、或者SEQ ID NO：2或其互补序列。本发明专利技术中的玉米事件T抗‑4对草甘膦除草剂具有较好的耐受性。

A Method of Generating Transgenic Herbicide Resistant Maize Event

【技术实现步骤摘要】
一种转基因抗除草剂玉米事件的创制方法
本专利技术涉及植物生物
具体的说，涉及一种转基因抗除草剂玉米的创制方法及其核苷酸序列。
技术介绍
田间杂草与作物竞争水、肥、光及生长空间，直接影响农作物产量与质量。同时许多杂草又是作物病原菌及害虫的中间寄主，是作物增产的重要生物限制因子之一。据联合国粮食与农业组织统计，全球因杂草导致的粮食生产损失每年高达950亿美元，相当于损失了3.8亿吨小麦，约合2009年全球小麦产量的半数以上。在950亿美元的经济损失中，贫困的发展中国家承受了大约700亿美元(FAO.Thelurkingmenaceofweeds[J/OL].(http.：//www.fao.org/news/story/en/item/29402/icode/)，2009-08-11.)。因此，有效地控制田间杂草是促进粮食增产的重要措施之一。在我国，危害玉米的杂草种类有40多种，其中危害较大的杂草有10多种。在一般年份杂草可使玉米减产10-20％，严重时更高达30-50％。另外，随着我国农村人口往城市迁移速度的加快，玉米种植的规模化和机械化是一个可预见的趋势，这使得传统的人工除草方式变得不现实。当前，市场上广泛应用的选择性除草剂施用量大，残留期长、容易影响下茬作物的正常生长。草甘膦等灭生性除草剂具有高效、低毒、易降解、无残留等特点。但它们除草没有选择性，不能直接用在作物的生长期。通过转基因技术培育耐该类灭生性除草剂的玉米可以克服这一难题。在玉米生长期喷施1-2次就能有效解决杂草问题，减少了除草剂的用量及投入成本。因此，耐除草剂转基因玉米具有非常广阔的应用价值和市场潜力。已知外源基因在植物体内的表达受到它们的染色体位置的影响，可能是由于染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)接近整合位点。为此，通常需要筛选大量的事件才有可能鉴定出可以商业化的事件(即导入的目标基因得到最优表达的事件)。例如，在植物和其他生物体中已经观察到导入基因的表达量在事件间可能有很大差异；在表达的空间或时间模式上可能也存在差异，如在不同植物组织之间转基因的相对表达存在差异，这种差异表现在实际的表达模式可能与根据导入的基因构建体中的转录调节元件所预期的表达模式不一致。因此，通常需要产生成百上千个不同的事件并从这些事件中筛选出具有以商业化为目的所预期的转基因表达量和表达模式的单一事件。具有预期的转基因表达量和表达模式的事件可用于采用常规育种方法通过有性异型杂交将转基因渗入到其他遗传背景中。通过这种杂交方式产生的后代保持了原始转化体的转基因表达特征。应用这种策略模式可以确保在许多品种中具有可靠的基因表达，而这些品种能很好的适应当地的生长条件。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种转基因抗除草剂玉米事件，所述转基因玉米事件T抗-4对草甘膦除草剂具有较好的耐受性。为实现上述目的，本专利技术提供了一种核酸序列，所述核酸序列包括SEQIDNO：1或其互补序列、和/或SEQIDNO：2或其互补序列，所述核酸序列源自转基因玉米事件T抗-4。进一步地，所述核酸序列包括SEQIDNO：3或其互补序列、和/或SEQIDNO：4或其互补序列。更进一步地，所述核酸序列包括SEQIDNO：5或其互补序列。所述SEQIDNO：1或其互补序列为转基因玉米事件T抗-4中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQIDNO：1或其互补序列跨越了玉米插入位点的左侧翼基因组DNA序列和插入序列的左边界5’末端的DNA序列，包含所述SEQIDNO：1或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件T抗-4的存在。所述SEQIDNO：2或其互补序列为转基因玉米事件T抗-4中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQIDNO：2或其互补序列跨越了插入序列的右边界3’末端的DNA序列和玉米插入位点的右侧翼基因组DNA序列，包含所述SEQIDNO：2或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件T抗-4的存在。所述SEQIDNO：5或其互补序列为表征转基因玉米事件T抗-4的长度为4601个核苷酸的序列，其具体包含的基因组和遗传元件如表1所示。包含所述SEQIDNO：5或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件T抗-4的存在。表1SEQIDNO：5包含的基因组及遗传元件1：单位bp。本专利技术还提供了一种转基因玉米抗除草剂玉米的制备方法，其步骤如下：a)构建含有SEQIDNO：5第3994244位核苷酸所示序列的转化载体；b)利用农杆菌介导的遗传转化方法将载体转化入玉米幼胚中，经恢复培养后选择愈伤长成新的转基因玉米植株；c)目的基因分子检测。根据基因序列设计PCR引物对，引物序列分别为SEQIDNO：12和SEQIDNO：13，选取转基因玉米叶片进行目的基因扩增，并保留检测结果阳性的植株；d)转基因玉米植株对除草剂耐受性筛选；e)转化体目的基因拷贝数检测，保留单拷贝植株；f)转化体侧翼分离及验证。在本专利技术创制转基因玉米的方法中，以下定义和方法可以更好地定义本专利技术和指导本领域的普通技术人员实施本专利技术，除非另作说明，根据本领域普通技术人员的常规的用法来理解术语。所述“玉米”是指玉蜀黍(Zeamays)，并且包括可以与玉米交配的所有植物品种，包括野生玉米种。所述“包含”是指“包括但不限于”。术语“植物”包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛(plantclumps)和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎秆、根、根尖、花药等。应理解为本专利技术范围内的转基因植物的部分包括但不限于植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶和根，以上植物部分源自事先用本专利技术的DNA分子转化的并因此至少部分地由转基因细胞组成的转基因植物或其子代。术语“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，包括编码序列前的调节序列(5’非编码序列)和编码序列后的调节序列(3’非编码序列)。“天然基因”是指天然发现具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含非天然发现的调节和编码序列。“内源基因”是指天然基因，所述天然基因位于生物体基因组中它的天然位置。“外源基因”是现存在于生物的基因组中且原来不存在的外来基因，也指经转基因步骤导入受体细胞的基因。外源基因可以包含插入非天然生物体的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序已经被引入基因组的基因。植物基因组中重组DNA已被插入的位点可以称为“插入位点”或“靶位点”。“侧翼DNA”可以包含天然存在于例如植物的生物体中的基因组或通过转化过程引入的外源(异源)DNA，例如与转化事件相关的片段。因此，侧翼DNA可以包括天然和外源DNA的组合。在本专利技术中，“侧翼区”或“侧翼序列”或“基因组边界区”或“基因组边界序列”是指至少3、5、10、11、15、20、50、100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000碱基对或更长的序列，其位于最初外源插入DNA分子的直接上游或下游并且与最初外源插入DNA分子相邻。当该侧翼区位于上游时，其也可以称为“左边界本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸序列，其特征在于，包括SEQ ID NO：1或其互补序列、和/或SEQ ID NO：2或其互补序列，所述核酸序列源自转基因玉米事件T抗‑4。

【技术特征摘要】
2019.01.02 CN 20191003394561.一种核酸序列，其特征在于，包括SEQIDNO：1或其互补序列、和/或SEQIDNO：2或其互补序列，所述核酸序列源自转基因玉米事件T抗-4。2.根据权利要求1所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括SEQIDNO：3或其互补序列、和/或SEQIDNO：4或其互补序列。3.根据权利要求2所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括SEQIDNO：5或其互补序列。4.一种转基因玉米...

【专利技术属性】
技术研发人员：余桂容，杜文平，宋军，徐利远，陈谦，邓自圆，张敏，林杨，
申请(专利权)人：四川省农业科学院生物技术核技术研究所，
类型：发明
国别省市：四川,51