金龟子绿僵菌在制备防治植物根结线虫病药物中的应用制造技术

本发明专利技术属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一株金龟子绿僵菌在制备防治植物根结线虫病药物和促进植株生长中的应用。本发明专利技术使用的金龟子绿僵菌为金龟子绿僵菌IBCCM321.93，该菌首次发现可以防治植物根结线虫，且对植物具有促生作用。线虫卵经过该菌的50%的发酵液滤液处理后，与对照相比，线虫的孵化的抑制率达到95.73%，南方根结线虫二龄幼虫经25%浓度的发酵液滤液处理2天后，线虫致死率达到100%，具有非常好的线虫抑制效果，适用于大规模推广。

【技术实现步骤摘要】
金龟子绿僵菌在制备防治植物根结线虫病药物中的应用
本专利技术属于植物病害生物防治
，具体涉及金龟子绿僵菌在制备防治植物根结线虫病药物中的应用。技术背景植物根结线虫是一种世界性分布的植物病原线虫，可以寄生植物的根部导致植物营养和水分吸收受到影响，造成植物生长不良。此外，根结线虫的危害还可以加重其它病原物对植物的危害。葫芦科、茄科和豆类等各种蔬菜均常有根结线虫病发生，一般可造成减产20％-30％，严重时达到75％以上。随着我国塑料大棚等设施栽培技术的大面积推广，根结线虫的为害逐渐加重。植物根结线虫的防治目前仍然是以化学农药为主。然而一些常见杀线剂如涕灭威等由于高毒、高残留等特性，根据新修订的《农药管理条例》多种具有防治线虫病害能力的农药(如涕灭威等)，将陆续在我国被禁用。此外，也发现线虫对噻唑膦等化学杀线剂出现了耐药性。因此，利用有益微生物对根结线虫病进行生物防治，一种可以替代的安全有效防治防治线虫病害策略。虽然目前已经发现了一些对根结线虫有生物防治效果的真菌如淡紫紫孢菌等，但不同的微生物作用机理及对环境的适应性都不相同，针对不同的生产应用需求难免出现一定的局限性，因此筛选更多更有效生防菌尤为重要。金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)是一种重要的昆虫病原真菌，并广泛应用昆虫的生物防治。本专利技术公布了利用金龟子绿僵菌孢子制剂对根结线虫进行防治的方法。在本专利技术之前，贵州绿僵菌(Metarhiziumguizhouense)是已报道的唯一可以寄生根结线虫的绿僵菌。而本专利技术中的金龟子绿僵菌与贵州绿僵菌属于不同的种，贵州绿僵菌可以寄生线虫的卵和二龄幼虫，而本专利技术中的金龟子绿僵菌则可以寄生线虫的卵和成熟的雌虫，且其发酵液可以抑制线虫卵的孵化并毒杀二龄幼虫。本专利技术的金龟子绿僵菌首次发现可用于防治植物根结线虫的同时，又对植物有促生作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了金龟子绿僵菌IBCCM321.93在制备防治植物根结线虫病药物中的应用。本专利技术的另一个目的在于提供了金龟子绿僵菌IBCCM321.93在制备同时防治植物根结线虫病和促进植物生长的制剂中的应用。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：金龟子绿僵菌IBCCM321.93在制备防治植物根结线虫病药物中的应用，包括以金龟子绿僵菌IBCCM321.93孢子或其发酵液为有效成分制备成防治根结线虫病的药物。另外，只要将金龟子绿僵菌IBCCM321.93孢子或其发酵液用于防治根结线虫病或/和促进植物生长，都属于本专利技术的保护范围。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1.本专利技术首次发现金龟子绿僵菌IBCCM321.93可以寄生线虫的卵和成熟的雌虫，且其发酵液可以抑制线虫卵的孵化并毒杀二龄幼虫，因此可用于抑制植物根结线虫的繁殖。2.本专利技术首次发现金龟子绿僵菌IBCCM321.93对植物具有促生作用，可作为促生剂使用。附图说明图1为金龟子绿僵菌菌株IBCCM321.93对根结线虫虫卵和成熟雌虫的寄生性示意图；其中：A和B分别为以清水处理5天作为对照的线虫卵及成熟雌虫；C和D分别为被金龟子绿僵菌孢子寄生5天后的线虫卵及成熟雌虫。图2为金龟子绿僵菌的发酵液对线虫卵孵化和对二龄线虫活性的影响示意图；其中：A为线虫的卵在查氏液体培养基可以正常卵孵，8天后出现大量的二龄幼虫；图B为用95％的金龟子绿僵菌的发酵液处理线虫的卵8天后，卵的孵化被抑制；C为用线虫的二龄幼虫在查氏液体培养基中2天后仍大量存活；D为线虫的二龄幼虫在用95％的金龟子绿僵菌的发酵液中2天后，线虫大量死亡，虫体呈僵直状。图3为金龟子绿僵菌对番茄根结线虫病的防治示意图；其中：A为用不同浓度的金龟子绿僵菌孢子制剂防治番茄根结线虫病害后，番茄的植株生长情况；B为用不同浓度的金龟子绿僵菌孢子制剂防治番茄根结线虫病害后，番茄的根部生长情况，箭头指向根部的根结；C为用不同浓度的金龟子绿僵菌孢子制剂防治番茄根结线虫病害后，番茄的植株高度和根长。图4为金龟子绿僵菌对番茄生长促进作用示意图；其中：A为不同浓度的金龟子绿僵菌孢子制剂处理番茄后，番茄植株的地上部分和根系的长度；B为不同浓度的金龟子绿僵菌孢子制剂处理番茄后，番茄植株的地上部分和根系的鲜重。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本专利技术实施例中所用的线虫均是南方根结线虫。实施例1：金龟子绿僵菌孢子对根结线虫的寄生性：金龟子绿僵菌IBCCM321.93(菌株保藏编号为CGMCCNo.0853)在PDA培养基上于28℃培养2天，然后用含有0.05％吐温的无菌水冲洗并收集孢子，并用擦镜纸过滤除去孢子中的菌丝。PDA的制备按常规方法进行，每200g马铃薯切小块煮熟，过滤收集滤液并加入20g葡糖糖，补水至总体积为1000ml即为PDB培养基；然后进行分装，每100ml培养基中加入1.5g的琼脂，高温蒸汽灭菌后制备成PDA培养基。线虫的卵在1％次氯酸钠中消毒2分钟，然后于25℃进行孵化以获得二龄幼虫。线虫的二龄幼虫和成熟雌虫则用0.5％次氯酸钠进行表面消毒。将玻璃纸剪成1cm2的小块，灭菌后平铺在直径9cm的水琼脂制备的平板上，每个培养皿可以平铺约10块玻璃纸。每块玻璃纸上滴10μl不同浓度的金龟子绿僵菌的孢子。以10μl的水滴在玻璃纸上作为对照。于28℃培养12h后，在玻璃纸上接种50个线虫的卵，或50条二龄幼虫，或50个成熟的雌虫。观察绿僵菌对线虫的寄生能力，结果表明绿僵菌对线虫的卵具有寄生能力，且随着时间的延长寄生效率不断增加(图1)。计数不同天数后的线虫孵化情况，表明金龟子绿僵菌通过寄生线虫的卵，对线虫的孵化具有很好的抑制效果，其中1×108个/ml的孢子处理8天后对线虫卵孵化的抑制率可以达到70％以上。只有少数二龄幼虫被金龟子绿僵菌寄生，但是大多数线虫的虫体周围有孢子附着，且虫体僵直活动能力下降。此外，金龟子绿僵菌可以寄生线虫的成熟雌虫(图1)，寄生率大于60％，从而导致线虫的繁殖能力下降，可以有效减少再侵染源。表1金龟子绿僵菌孢子对线虫卵孵化的抑制率实施例2：金龟子绿僵菌发酵液滤液对根结线虫的毒杀性：在100ml的查氏培养基(硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，蒸馏水1000ml，pH6-6.5)中接种金龟子绿僵菌直径7mm的菌丝块2块，然后于160rpm，28℃振荡培养2周后离心除去菌丝体，同时用直径0.22μm的滤膜过滤以充分除去真菌组织。将绿僵菌的发酵液滤液用查氏培养基进行稀释，至发酵液的终浓度分别为95％，50％，25％和10％(v/v)。将线虫的卵或二龄幼虫进行表面消毒后置于水中，并调整至每50μl溶液中含100个卵或者100条二龄幼虫。取50μl的线虫卵或者二龄幼虫容易置于含有950μl不同浓度发酵滤液的24孔细胞培养板中。以查氏培养基替代发酵滤液作为对照。将细胞培养板置于25℃，并观察不同浓度的发酵液对线虫的影响。结果发现金龟子绿僵菌的发酵液滤液对线虫的卵的孵化有明显的抑制性，且抑制效果随着发酵滤液浓度的增加而增加(图2)。其中50％的发酵液滤液与查氏液体培养基相比，对照中线虫的孵化的抑制率达到9本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.金龟子绿僵菌IBCCM321.93在制备防治植物根结线虫病药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.金龟子绿僵菌IBCCM321.93在制备防治植物根结线虫病药物中的应用。2.金龟子绿僵菌IBCCM321.93发酵液滤液在制备抑制植物根结线虫幼虫或植物根结线虫卵孵化的药物中的应用。3.金...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖雪琼，肖炎农，王高峰，辛西娅·萨文，刘娟，谢冲，莫陈汨，黄求应，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42