一种单细胞RNA测序文库构建方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，本发明专利技术提供了一种单细胞RNA测序文库构建方法，所述方法包括：(1)向单细胞裂解体系中加入carrier RNA，以实现建库RNA量，且无需对全长cDNA进行预扩增；(2)利用商品化试剂盒或RNA测序文库构建方法以构建文库；(3)去除文库中carrier RNA转录而成的DNA；(4)高通量测序。本发明专利技术免除了现有方法中对于全长cDNA进行预扩增的步骤，文库构建过程中将加入的已知序列的RNA进行酶切剔除，使之不会对测序造成干扰，大幅降低了测序成本。

A Construction Method of Single Cell RNA Sequencing Library

【技术实现步骤摘要】
一种单细胞RNA测序文库构建方法
本专利技术涉及单细胞RNA测序领域，包括单细胞转录组RNA，smallRNA，以及RNA链特异性测序文库构建的材料和方法。
技术介绍
在过去，利用微阵列(Microarray)来获得基因表达图谱，随着二代测序技术的发展，RNA-Seq也因其通量高、定量准、可重复性高并且可用于亚型(isoform)和单核苷酸多态性位点(SNP)检测等特点逐渐被科学和临床研究广泛使用，这些方法大都建立在获取了很多细胞，有大量RNA的前提之下。事实是，这些方法并不能呈现出每个细胞中基因表达的差异，仅仅反映了多细胞整体中基因的绝对表达量。很多情况下，样本细胞数稀少而珍贵，可获得的细胞量有限，不能达到普通多细胞RNA-Seq的建库标准，比如对胚胎植入前的遗传检测和筛查；此外，组织样本中单个细胞之间的异质性研究价值很高，比如肿瘤组织细胞亚群分析，循环肿瘤细胞和胚胎发育过程中基因的表达差异的研究，找到一些新的生物学标记作为生物学研究和医学治疗的潜在靶标，这些研究都需要一种有力的单细胞RNA-Seq方法来支持。一个哺乳动物的单细胞中总的RNA量是10pg左右，其中转录组RNA仅占其中的1％-5％，其他绝大部分是核糖体RNA、转运RNA和一些小RNA，这些极少量的转录组RNA远不能达到普通多细胞RNA-Seq文库构建的最低起始量(100ng总RNA，至少需要104个细胞)，(常规试剂盒中的限定最低起始量)并且在操作过程中由于单个细胞裂解不充分、RNA降解还会造成大量的RNA的损失。为了解决这种问题，现有的单细胞RNA-Seq文库构建的方法采取两种方式对极少量的转录组RNA进行扩增，最早报道了单细胞测序方法的Surani实验室使用的是一种是对反转录所得的cDNA两端加上已知序列的引物，然后进行PCR扩增的方法；另一种CEL-Seq方法是通过引入T7启动子序列，对cDNA进行体外转录扩增。但是这两种扩增方式都无法避免在扩增中产生偏差(由于全长cDNA的长度不同，GC含量不同)，这样的序列依赖性扩增偏差会造成基因表达差异的不真实体现，这也是目前所有单细胞测序方法中存在的问题。此外，大多数单细胞转录组RNA-Seq的测序方法SCRB-Seq、CEL-Seq、Drop-Seq在转录本覆盖这一方面都存3’端富集的问题，转录组的全面覆盖对于研究基因的亚型和单核苷酸多态性位点等问题都十分重要。Smart-Seq方法是目前单细胞RNA-Seq方法中比较有突出优势的技术，利用模板转换机制对全长cDNA进行扩增，提高了转录组覆盖率，但依旧存在扩增偏差和长基因(转录本>6kb)全长覆盖的问题，而且这种方法相较于其他方法成本较高。链特异性的RNA文库构建，使得可以直接获得原始RNA转录的链的信息，链的信息对于研究非编码RNA，以及基因的转录真实转录信息和基因表达边界的研究有重要意义。在基因组上大约有19％的基因反义链上会出现转录，如果不区分链信息，则对于基因表达量的统计会存在偏差，此外反义链的转录信息对于细胞状态和类型的区分也有价值。目前，由于单细胞RNA建库前的扩增，转录本全长的链信息依旧不能获取。在哺乳动物的细胞中，smallRNA通常是指17-200nt的RNA，其中大部分是非编码RNA(noncodingRNA)，研究最多的是和RNAi相关的microRNA(miRNA)以及小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)，其他的smallRNA主要包括了piwi-interactingRNA(piRNA)，smallnucleolarRNA(snoRNA)和一些小核糖体RNA(rRNA)，小转运RNA(tRNA)。近年来的研究发现很多癌症特异表达的miRNA，随着研究的不断深入，对于肿瘤的亚型分析和检测miRNA可以作为新的生物标记(biomarker)，miRNA对于靶基因的转录调控也是研究热点。此外，在生物体胚胎早期发育过程中，smallRNA起着重要作用，但是由于胚胎的珍贵和有限的细胞数，RickardSandberg实验室发表了单细胞smallRNA的文库构建方法，仅仅对于单细胞中的smallRNA进行捕获丢失了其余转录组的信息，此项专利技术将首次对于单个细胞中转录组和smallRNA共同捕获，对于研究单细胞层面的转录信息提供了更加全面的参考。D等人公布一种RNA单细胞水平的全长mRNA测序(NatureBiotechnology,2012,30(8):777-82.)；PicelliS等人公布一种用于单细胞的敏感全长转录组测序的Smart-seq2方法(NatureMethods,2013,10(11):1096)是被广泛使用的单细胞测序方法。但目前该技术还存在以下方面的不足：该技术只针对mRNA文库构建，对于全长cDNA进行预扩增，不可避免的造成基因表达情况的不真实体现；不能获得多种转录本RNA的信息和全长的转录本链信息，该方法在全长转录本的覆盖情况和基因表达情况检测与常规RNA-seq相比较并不理想。因此、有必要开发一种新的单细胞RNA测序文库的构建方法。
技术实现思路
针对以上问题，本专利技术提供了一种新的单细胞RNA测序文库的构建方法，本专利技术可有效减少扩增偏差，真实体现、定量单细胞基因表达情况，同时首次实现单细胞中的smallRNA和转录组RNA双文库构建和单细胞链特异性RNA文库构建。本专利技术通过加入人工合成的已知序列RNA或DNA，达到大量细胞的建库RNA量，免除了现有方法中对于全长cDNA进行预扩增的步骤，文库构建过程中将加入的已知序列的RNA进行酶切剔除，使之不会对测序造成干扰，降低测序成本。本专利技术单细胞RNA测序文库构建方法，其包括如下步骤：(1)向单细胞裂解体系中加入carrierRNA以实现建库RNA量，且无需对全长cDNA进行预扩增；(2)利用商品化试剂盒或RNA测序文库构建方法以构建文库；(3)剔除文库中由carrierRNA转录而得的DNA；(4)进行高通量测序。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述步骤(1)中carrierRNA可以采用已知的carrierRNA序列或其他RNA测序文库构建方法构建文库。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述步骤(1)中已知的carrierRNA包括但不限于含有3’端多聚腺苷酸尾的carrierRNA；不含有3’端多聚腺苷酸尾的carrierRNA；5’端磷酸化SmallcarrierRNA；或带有修饰的carrierRNA等等；作为实施方案之一，所述带有修饰的carrierRNA包括但不限于含有m6A修饰的、m1A修饰的、m7G修饰的或biotin修饰的carrierRNA等等。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述步骤(1)中的carrierRNA包括不限于直接化学合成的carrierRNA，或通过含有T7启动子的DNA模板体外转录获得的carrierRNA，其长度范围为10-10000nt；或在smallRNA文库构建过程中加入的含有5’端磷酸化的smallRNAcarrier；本专利技术方法中，作为实施方案之一，其中所述carrierRNA序列中的每50个碱基序列不能都与测序物种的基因组相匹配；或对于不足50个碱基的carri本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单细胞RNA测序文库构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)向单细胞裂解体系中加入carrier RNA，以实现建库RNA的量，且无需对全长cDNA进行预扩增；(2)利用商品化试剂盒或RNA测序文库构建方法以构建文库；(3)剔除文库中由carrier RNA转录而来的DNA；(4)进行高通量测序。

【技术特征摘要】
1.一种单细胞RNA测序文库构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)向单细胞裂解体系中加入carrierRNA，以实现建库RNA的量，且无需对全长cDNA进行预扩增；(2)利用商品化试剂盒或RNA测序文库构建方法以构建文库；(3)剔除文库中由carrierRNA转录而来的DNA；(4)进行高通量测序。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的carrierRNA包括含有3’端多聚腺苷酸尾的carrierRNA；不含有3’端多聚腺苷酸尾的carrierRNA；5’端磷酸化SmallcarrierRNA；或带有修饰的carrierRNA；优选含有m6A修饰、m1A修饰、m7G修饰或biotin修饰的carrierRNA。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的carrierRNA包括直接化学合成的carrierRNA，或是通过含有T7启动子的DNA模板体外转录获得的carrierRNA，其长度范围为10-10000nt，优选150-300nt；或在smallRNA文库构建过程中加入的含有5’端磷酸化的smallRNAcarrier；其中所述carrierRNA序列中的每50个碱基序列都不能与测序物种的基因组相匹配；或对于不足50个碱基的carrierRNA的全长序列不能与测序物种的基因组相匹配。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)所述单细胞裂解体系包括单个或小于100ng的细胞RNA或总RNA量小于100ng的单细胞裂解体系。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中加入的carrierRNA量的范围为5ng–1μg；优选100ng-1μg以实现步骤(2)中利用商品化试剂盒或RNA测序文库构建方法进行构建文库。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述商业化试剂盒包括用...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾俊岭，肖政云，程果，吴超，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33