一种乳腺癌无创分子分型试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供的一种乳腺癌无创分子分型试剂盒及方法，旨在提供一种使用简单，检测准确率高的试剂盒；以及样本易得、取样流程简单、临床体验较好、且可流程化操作，非常适合临床应用的非疾病诊断目的的乳腺癌无创分子分型的方法；其技术方案包括血浆游离DNA提取试剂、文库构建试剂、测序试剂、测序芯片，该方法基于对血浆游离DNA高通量测序数据，通过生物信息学分析，获得血浆游离DNA中全基因组范围内启动子区的核小体足迹差异信息，进而根据足迹信息的差异对乳腺癌患者实现管腔A型、管腔B型、HER2富集型和基底细胞型四种类别的无创分子分型；属于生物技术领域。

A non-invasive molecular typing kit and method for breast cancer

【技术实现步骤摘要】
一种乳腺癌无创分子分型试剂盒及方法
本专利技术提供了一种乳腺癌无创分子分型产品，具体地说，是一种基于血浆游离DNA高通量测序技术的乳腺癌无创分子分型产品，本专利技术还是涉及该分子产品的构建方法，属于生物

技术介绍
乳腺癌是女性最常见的浸润性癌症。根据世界卫生组织2015年报道，全球每年新增的乳腺癌病例约115万例，死亡病例约41万例，并且发病率逐年增加。乳腺癌也是中国女性最常见的癌症，每年中国乳腺癌新发数量和死亡数量分别占全世界的12.2％和9.6％。乳腺癌的分子分型与乳腺癌的治疗和预后密切相关。目前乳腺癌分子分型方法主要采用2013年乳腺癌国际会议上规定的乳腺癌分类标准。即采用免疫组织化学方法，根据癌组织中雌激素受体(estrogenreceptor,ER)、孕激素受体(progester-onereceptor,PR)和HER-2的检测结果，将乳腺癌分为4种分子亚型：管腔A型(luminalA)、管腔B型(luminalB)、HER2富集型(HER2-enriched)和基底细胞型(basal-like)。分子分型结果广泛用于临床治疗方案的确定、疗效和预后判断等不同亚型乳腺癌的生物学行为、治疗策略和预后存在明显差异。管型为激素受体表达阳性，预后良好；HER-2型为激素受体无表达但HER-2表达阳性，预后虽较导管型差但可通过特定的靶点治疗得到明显改善。基底细胞样型，即通常所说的三阴性乳腺癌，治疗效果和预后较差。目前的分子分型方法都是基于有创的诊断方法，即通过针吸细胞学检查、切取活检等直接对人体组织有创伤的检查手段，目的是获取肿瘤细胞或肿瘤组织、转移淋巴结。这种有创的诊断方法增加了患者的痛苦及肿瘤播散的风险。此外由于肿瘤组织具有较大异质性，局部穿刺的活检分析有可能造成结果偏倚，针对活检组织的病理诊断也需要具有良好的病理学理论基础和实践经验。需要二次活检的患者需要确定肿瘤进展部位，对于已手术切后的患者后期则无法获取可用的组织标本来判断预后及转移情况。细胞死亡或者快速分裂时，会释放游离的DNA进入外周血，主要分布于血浆和血清中。在正常人中，游离DNA主要来源于造血细胞。由于细胞坏死或者细胞更新速度变快，感染、缺血、肿瘤、自身免疫性疾病、肥胖和怀孕时，体内游离DNA含量会增加。在肿瘤的发生发展过程中，肿瘤细胞也会释放DNA至外周血中，即游离得肿瘤细胞DNA(cellfreetumorDNA,ctDNA)。cfDNA和ctDNA的发现及ARMS-PCR和高通量测序技术的发展为无创性检测带来了新的契机。ctDNA可代替肿瘤组织广泛应用于肿瘤的早期筛查、辅助诊断、靶向药物选择和预后疗效监测。所以肿瘤患者血浆游离DNA主要来源于快速代谢的造血细胞和肿瘤细胞。即血浆游离DNA是细胞死亡后，染色质经酶切片段化后形成DNA片段，其半衰期很短，半小时就会被清除。其中被核小体固定的DNA序列因核小体保护而降解速度较慢，而裸露的DNA序列很快被降解，所以游离DNA长度一般为核小体固定长度的整数倍。不同的肿瘤组织、不同类型的肿瘤细胞，其血浆游离DNA的核小体足迹是存在差异的。可以通过高通量测序技术对血浆cfDNA进行全基因组测序，获得核小体定位信息，通过定位信息对患者进行分子分型。
技术实现思路
针对上述不足，本专利技术的第一个目的是提供一种使用简单，检测准确率高的试剂盒。本专利技术的第二个目的是提供一种样本易得、取样流程简单、临床体验较好、且可流程化操作，非常适合临床应用的非疾病诊断目的的乳腺癌无创分子分型的方法。为此，本专利技术提供的第一个技术方案是这样的：一种乳腺癌无创分子分型的试剂盒，包括血浆游离DNA提取试剂、文库构建试剂、测序试剂、测序芯片。本专利技术提供的第二个技术方案是这样的：一种非疾病诊断目的的乳腺癌无创分子分型的方法，基于对血浆游离DNA高通量测序数据，通过生物信息学分析，获得血浆游离DNA中全基因组范围内启动子区的核小体足迹差异信息，进而根据足迹信息的差异对乳腺癌患者实现管腔A型、管腔B型、HER2富集型和基底细胞型四种类别的无创分子分型。进一步的，上述的非疾病诊断目的的乳腺癌无创分子分型的方法，所述的核小体足迹差异是血浆游离DNA全基因组范围内每个基因转录起始位点TSSs区域的核小体分布与该基因其余区域的差异，与核小体解离的区域被快速降解掉导致差异产生的。进一步的，上述的非疾病诊断目的的乳腺癌无创分子分型的方法，具体包括以下步骤：(1)血浆游离DNA的高通量测序采用权利要求1所述的血浆游离DNA提取试剂，提取血浆的游离DNA，进行末端修复、接头连接、PCR扩增形成测序文库，进行高通量测序，每个样本至少检测6Mreads的数据量；(2)核小体印迹分析通过UCSC的RefSeq数据库，获得目前人类蛋白编码基因的启动子区域，数据库注释信息计算统计每个基因的转录起始位点TSSs上下游1Kb区域的基因组位置，并将该区域定义为原始启动子区域；采用权利要求1测序的原始数据，利用Bowtie软件对测序数据进行比对，去除比对数据中的重复序列，统计出每个蛋白编码基因的原始启动子区域的reads数，并利用RPKM方法对数据进行标准化，原始启动子区域覆盖度能够提示核小体印迹，覆盖度越低核小体结合数目较少，反之核小体数目较多；(3)核小体足迹差异分析根据核小体足迹差异，利用Kruskal-Wallis非参数单因子方差分析筛选出管腔A型、管腔B型、HER2富集型和基底细胞型组中存在覆盖度差异的基因启动子区域，通过秩和检验同一个基因的4组覆盖度数值进行两两比较，并利用holm法对P值进行校正，筛选出FDR值小于0.1的基因启动子区域；(4)聚类分析利用Cluster软件对差异表达的基因启动子覆盖度数据进行标准化，采用等级聚类法根据样本间的相关性对标准化后的数据进行聚类分析，并用R语言pheatmap包对数据进行可视化展示；根据TSSs区核小体的印迹差异，样本类型聚类为管腔A型、管腔B型、HER2富集型和三阴型4类。进一步的，上述的非疾病诊断目的的乳腺癌无创分子分型的方法，步骤(1)所述的高通量测序是根据常规的血浆游离DNA基因组高通量测序方法进行，最终获得大于6Mreads的数据量。进一步的，上述的非疾病诊断目的的乳腺癌无创分子分型的方法，步骤(1)所述的高通量测序的检测平台为iontorrentproton测序平台。更进一步的，上述的非疾病诊断目的的乳腺癌无创分子分型的方法，所述的血浆游离DNA的高通量测序具体方法为：步骤一)外周血血浆的制备采用两步离心法进行血浆分离步骤二)血浆游离DNA提取使用血浆游离DNA提取试剂盒提取血浆游离DNA，提取完成后，使用Qubit3.0进行浓度测定；步骤三)文库构建及定量使用IonPlusFragmentLibraryKit试剂盒对DNA进行末端修复，磁珠纯化后使用DNA连接酶在DNA两端添加上测序接头，连接产物进行磁珠纯化后进行扩增，磁珠纯化后即完成文库构建，进行浓度测定；根据浓度将每个文库稀释到100pM，使用ABI7500进行QPCR定量后，每10个文库等量进行混合，使其终浓度为100pM；步骤四)高通量测序使用IonPITMHi-QTMOT2200Kit对混合文库进行乳液PCR，使文库与测序I本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乳腺癌无创分子分型的试剂盒，其特征在于，包括血浆游离DNA提取试剂、文库构建试剂、测序试剂、测序芯片。

【技术特征摘要】
1.一种乳腺癌无创分子分型的试剂盒，其特征在于，包括血浆游离DNA提取试剂、文库构建试剂、测序试剂、测序芯片。2.一种非疾病诊断目的的乳腺癌无创分子分型的方法，其特征在于，该方法基于对血浆游离DNA高通量测序数据，通过生物信息学分析，获得血浆游离DNA中全基因组范围内启动子区的核小体足迹差异信息，进而根据足迹信息的差异对乳腺癌患者实现管腔A型、管腔B型、HER2富集型和基底细胞型四种类别的无创分子分型。3.根据权利要求2所述的非疾病诊断目的的乳腺癌无创分子分型的方法，其特征在于，所述的核小体足迹差异是血浆游离DNA全基因组范围内每个基因转录起始位点TSSs区域的核小体分布与该基因其余区域的差异，与核小体解离的区域被快速降解掉导致差异产生的。4.根据权利要求2所述的非疾病诊断目的的乳腺癌无创分子分型的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)血浆游离DNA的高通量测序采用权利要求1所述的血浆游离DNA提取试剂，提取血浆的游离DNA，进行末端修复、接头连接、PCR扩增形成测序文库，进行高通量测序，每个样本至少检测6Mreads的数据量；(2)核小体印迹分析通过UCSC的RefSeq数据库，获得目前人类蛋白编码基因的启动子区域，数据库注释信息计算统计每个基因的转录起始位点TSSs上下游1Kb区域的基因组位置，并将该区域定义为原始启动子区域；采用权利要求1测序的原始数据，利用Bowtie软件对测序数据进行比对，去除比对数据中的重复序列，统计出每个蛋白编码基因的原始启动子区域的reads数，并利用RPKM方法对数据进行标准化，原始启动子区域覆盖度能够提示核小体印迹，覆盖度越低核小体结合数目较少，反之核小体数目较多；(3)核小体足迹差异分析根据核小体足迹差异，利用Kruskal-Wallis非参数单因子方差分析筛选出管腔A型、管腔B型、HER2富集型和基底细胞型组中存在覆盖度差异的基因启动子区域，通过秩和检验同一个基因的4组覆盖度数值进行两两比较，并利用holm法对P值进行校正，筛选出FDR值小于0.1的基因启动子区域；(4)聚类分析利用Cluster软件对差异表达的基因启动子覆盖度数据进行标准化，采用等级聚类法根据样本间的相关性对标准化后的数据进行聚类分析，并用R语言pheatmap包对数据进行可视化展示；根据TSSs区核小体的印迹差异，样本类型聚类为管...

【专利技术属性】
技术研发人员：李坤，胥顺，杨学习，
申请(专利权)人：广州市雄基生物信息技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44