通过纳米孔指导的核酸检测方法技术

本发明专利技术提供一种检测样品中的靶多核苷酸的方法，其包含：(a)使所述样品与跟所述靶多核苷酸中的序列结合的指导多核苷酸和多核苷酸指导的效应蛋白接触，其中所述指导多核苷酸和多核苷酸指导的效应蛋白与所述样品中存在的任何靶多核苷酸形成复合物；(b)使所述样品与包含跨膜孔的膜接触；(c)对所述膜施加电位；以及(d)监测由所述复合物与所述跨膜孔的相互作用引起的效应的存在或不存在，以确定所述复合物的存在或不存在，从而检测所述样品中的所述靶多核苷酸。

Nucleic acid detection guided by nanopore

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过纳米孔指导的核酸检测方法
本专利技术大体上涉及一种使用跨膜孔来检测和/或分析靶多核苷酸的方法。本专利技术还涉及用于所述方法中的新颖探针和探针组以及用于实施所述方法的试剂盒。所述方法有许多用途。具体来说，所述方法可以用于多态性的诊断、检测以及V(D)J谱系分析。
技术介绍
当前在广泛的应用范围内需要快速且便宜的多核苷酸(例如，DNA或RNA)测序和鉴定技术。现有技术缓慢且昂贵，主要是因为它们依赖于扩增技术来产生大量多核苷酸并且需要大量的专用荧光化学品进行信号检测。跨膜孔(和其它纳米孔)作为聚合物和各种小分子的直接电子生物传感器具有巨大的潜力。具体来说，最近正在关注纳米孔作为潜在的DNA测序技术。当跨纳米孔施加电位时，当如核苷酸等分析物在桶中暂时停留一段时间时，电流会发生改变。核苷酸的纳米孔检测给出了已知特征和持续时间的电流改变。在链测序方法中，使单条多核苷酸链通过孔并且推导出核苷酸的同一性。链测序可以涉及使用分子刹车来控制多核苷酸通过孔的移动。
技术实现思路
本专利技术人已经鉴定了指导RNA和DNA以及RNA指导的和DNA指导的效应蛋白的新用途，其形成CRISPR基因编辑机制的一部分。本专利技术人设计了经过修饰的指导RNA序列，其可以与相关的RNA指导的效应蛋白结合使用，以测试样品中一种或多种靶多核苷酸的存在、不存在或量。本专利技术人已经开发了使用指导RNA和RNA指导的效应蛋白并结合跨膜孔来检测靶多核苷酸的方法。所述方法可以通过多种方式进行，但共同的是它们使用指导RNA和RNA指导的效应蛋白来选择靶多核苷酸并涉及向跨膜孔递送包含靶多核苷酸、指导RNA和RNA指导的效应蛋白的复合物。所述方法可以扩展到其它多核苷酸指导的蛋白质效应系统，包括使用C2c2的RNA编辑系统。指导多核苷酸，例如指导RNA，可以特别适用于基于纳米孔的检测方法。本专利技术人开发的方法是灵敏的，并且可用于检测样品中痕量的多核苷酸，而不需要单独的分离步骤来把靶多核苷酸从样品中的其它组分中萃取出来。因此，所述方法简单并且不需要复杂的步骤，例如富集或纯化步骤。因此，所述方法是快速的并且可以用于获得快速结果和从粗制和/或“脏”样品获得结果。因此，所述方法在需要快速诊断的诊断设置中特别有用。所述方法还特别适用于靶向基因或基因组的特定片段或区域。所述方法的关键益处是：在测量靶或衔接子之前，不是非常需要从靶多核苷酸中去除多核苷酸指导的效应蛋白。在本专利技术的一些实施例中，靶多核苷酸可以被检测或表征，同时仍与多核苷酸指导的效应蛋白连接。在本专利技术的其它实施例中，多核苷酸指导的效应蛋白可以在靶的测量期间通过跨膜孔自动去除。在一些实施例中，所述方法使用特别设计的指导多核苷酸以促进靶多核苷酸与样品中的其它组分的分离。所述方法使得能够对含有许多其它多核苷酸序列的样品中的多核苷酸序列的感兴趣的区域进行表征，例如测序，因为它固有地包括分离步骤。例如，可以仅对存在于大基因组中的感兴趣的基因进行测序。测序可以限于含有SNP的区域，或者限于其它感兴趣的区域，例如T细胞中的V(D)J区域。这提高了灵敏度和效率，无需复杂或耗时的片段化或下拉样品制备方法即可访问所需信息。它还减少了进行纳米孔实验所花费的时间，因为仅测量感兴趣的靶多核苷酸片段，或者相对于样品中的总多核苷酸片段，其测量比例增加。在非靶多核苷酸的量超过靶多核苷酸的量的情况下，由于不需要测量非靶多核苷酸或测量非靶多核苷酸的需求降低，所以检测靶多核苷酸所花费的时间会显著减少。所述方法还受益于不需要PCR或其它靶富集方法。因此，本专利技术提供一种检测样品中的靶多核苷酸的方法，其包含：(a)使所述样品与跟所述靶多核苷酸中的序列结合的指导多核苷酸和多核苷酸指导的效应蛋白接触，其中所述指导多核苷酸和多核苷酸指导的效应蛋白与所述样品中存在的任何靶多核苷酸形成复合物；(b)使所述样品与包含跨膜孔的膜接触；(c)跨所述膜施加电位差；以及(d)监测由所述复合物与所述跨膜孔的相互作用引起的效应的存在或不存在，以确定所述复合物的存在或不存在，从而检测所述样品中的所述靶多核苷酸。还提供了一种检测样品中的靶多核苷酸的方法，其包含：(a)使所述样品与跟所述靶多核苷酸中的序列结合的指导多核苷酸和多核苷酸指导的效应蛋白接触，其中所述指导多核苷酸和多核苷酸指导的效应蛋白与所述样品中存在的任何靶多核苷酸形成复合物；(b)使所述样品与纳米孔接触；(c)跨所述纳米孔施加电位差；以及(d)监测由所述复合物与所述纳米孔的相互作用引起的效应的存在或不存在，以确定所述复合物的存在或不存在，从而检测所述样品中的所述靶多核苷酸。本专利技术还提供了：-一种指导多核苷酸，其包含与靶多核苷酸中的序列结合的核苷酸序列、与多核苷酸指导的效应蛋白结合的核苷酸序列以及衔接子序列和/或能够与表面偶联的锚；-一组两种或更多种本专利技术的指导多核苷酸；-一种指导多核苷酸/多核苷酸指导的效应蛋白复合物，其包含本专利技术的指导多核苷酸和多核苷酸指导的效应蛋白；-一种试剂盒，其包含：多核苷酸指导的效应蛋白和能够与表面偶联的锚；以及-一种检测样品中的包含双链多核苷酸的靶的方法，其包含：(a)使所述样品与第一探针和第二探针接触，其中所述第一探针和所述第二探针与所述样品中存在的任何靶多核苷酸形成复合物，所述第一探针与所述靶双链多核苷酸中的第一序列结合并且包含能够与表面偶联的锚，并且所述第二探针与所述靶双链多核苷酸中的第二序列结合并且包含衔接子序列；(b)使所述样品与跨膜孔接触；(c)对所述跨膜孔施加电位；以及(d)监测由所述复合物与所述跨膜孔的相互作用引起的效应的存在或不存在，以确定所述复合物的存在或不存在，从而检测所述样品中的所述靶双链多核苷酸。附图说明应理解的是，附图仅用于说明本专利技术的特定实施例而并不旨在是限制性的。图1显示了携带延伸的CRISPRRNA(crDNA)的灭活CRISPR-Cas9复合物如何用于接触特定基因组DNA序列‘a’的实例。在此图中，Cas9蛋白A接触基因组DNAB中的特定基因座a。CRISPRRNAC携带a的序列，其在‘PAM’位点D之前。Cas9催化a的解链和与非靶链a'的杂交。crRNA还可以携带与tracrRNAE具有部分互补性的序列和延伸部分F，其使得锚定多核苷酸或多核苷酸结合蛋白负载的多核苷酸能够杂交。tracrRNA还可以携带延伸部分G，其使得锚定多核苷酸或多核苷酸结合蛋白负载的多核苷酸能够杂交。或者，Cas9可以携带肽标签，或多核苷酸亲和标签，或反应性部分H，其使得蛋白质能够结合或下拉至表面以进行锚定或纯化。还显示了野生型Cas9核酸酶的典型裂解位点I、J，它们两个在‘死的’Cas9(dCas9)中均被灭活，并且其中一个在Cas9的‘切口酶’突变体(化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)蛋白中的残基H10和D840的突变)中被灭活。图2显示了图1的替代方法，其中具有零个或一个灭活核酸酶位点的CRISPR-Cas9与特定基因座结合(如图1所示)，并且携带酶B和与序列a互补的序列的衔接子延伸并且直接连接到靶DNA。图C显示了活性或部分活性Cas9核酸酶在一个或两个位点D和E处诱导的靶中的双链断裂。图F显示了由物种B与CRISPR-Cas9复合物的置换链的结合诱导的CRIS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测样品中的靶多核苷酸的方法，其包含：(a)使所述样品与跟所述靶多核苷酸中的序列结合的指导多核苷酸和多核苷酸指导的效应蛋白接触，其中所述指导多核苷酸和多核苷酸指导的效应蛋白与所述样品中存在的任何靶多核苷酸形成复合物；(b)使所述样品与包含跨膜孔的膜接触；(c)跨所述膜施加电位差；以及(d)监测由所述复合物与所述跨膜孔的相互作用引起的效应的存在或不存在，以确定所述复合物的存在或不存在，从而检测所述样品中的所述靶多核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.29 GB 1616590.41.一种检测样品中的靶多核苷酸的方法，其包含：(a)使所述样品与跟所述靶多核苷酸中的序列结合的指导多核苷酸和多核苷酸指导的效应蛋白接触，其中所述指导多核苷酸和多核苷酸指导的效应蛋白与所述样品中存在的任何靶多核苷酸形成复合物；(b)使所述样品与包含跨膜孔的膜接触；(c)跨所述膜施加电位差；以及(d)监测由所述复合物与所述跨膜孔的相互作用引起的效应的存在或不存在，以确定所述复合物的存在或不存在，从而检测所述样品中的所述靶多核苷酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述指导多核苷酸是指导RNA并且所述多核苷酸指导的效应蛋白是RNA指导的效应蛋白。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述RNA指导的效应蛋白是RNA指导的核酸内切酶，或这样的RNA指导的核酸内切酶，其中所述RNA指导的核酸内切酶的核酸酶活性被禁用。4.根据权利要求3所述的方法，其中：(i)所述RNA指导的核酸内切酶的一个或多个催化核酸酶位点被灭活；和/或(ii)所述RNA指导的核酸内切酶是Cas、Cpf1或C2c2。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述Cas是Cas9。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸是双链的或包含双链区域和/或是DNA、DNA/RNA杂交体或RNA。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包含在步骤(b)之前选择性地使任何未与所述靶多核苷酸特异性结合的多核苷酸指导的效应蛋白变性和/或去除任何未与所述靶多核苷酸特异性结合的多核苷酸指导的效应蛋白。8.根据权利要求7所述的方法，其中任何未与所述靶多核苷酸特异性结合的多核苷酸指导的效应蛋白通过加热到约50℃至约60℃而变性。9.根据权利要求7或8所述的方法，其中未与所述靶多核苷酸特异性结合的多核苷酸指导的效应蛋白与包含所述指导多核苷酸、多核苷酸指导的效应蛋白以及靶多核苷酸的所述复合物通过使所述样品中的所述多核苷酸与珠粒或柱子结合而分离。10.根据权利要求9所述的方法，其包含向所述样品中加入聚乙二醇(PEG)和氯化钠并使所述样品与涂有羧基的顺磁珠接触，使得所述样品中存在的所述多核苷酸与所述珠粒结合。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述指导多核苷酸包含与所述靶多核苷酸中的序列结合的核苷酸序列和与所述多核苷酸指导的效应蛋白结合的核苷酸序列。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述指导多核苷酸是包含与所述靶多核苷酸中的序列结合的crRNA和tracrRNA的指导RNA。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述指导RNA是sgRNA。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述指导多核苷酸、所述多核苷酸指导的效应蛋白或所述靶多核苷酸具有能够与其所连接的所述膜偶联的锚。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述锚包含胆固醇。16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述锚通过与所述指导多核苷酸上的延伸部分杂交的多核苷酸而与所述指导多核苷酸连接。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述指导多核苷酸、所述多核苷酸指导的效应蛋白或所述靶多核苷酸具有能够与其所连接的表面偶联的结合部分。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述表面是珠粒的表面。19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述结合部分是所述指导多核苷酸上的末端延伸部分。20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中指导多核苷酸包含两个结合部分，它们任选地是所述指导多核苷酸上的末端延伸部分。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述指导多核苷酸包含第一末端延伸部分和第二末端延伸部分，并且所述方法包含在步骤(b)之前：(i)使所述样品与结合有第一捕获寡核苷酸的表面接触，所述第一捕获寡核苷酸包含与所述第一末端延伸部分互补的序列，使得所述指导多核苷酸/多核苷酸指导的效应蛋白/靶多核苷酸复合物与所述表面结合；(ii)使与所述表面结合的所述指导多核苷酸/多核苷酸指导的效应蛋白/靶多核苷酸复合物与竞争寡核苷酸接触，使得所述指导多核苷酸/多核苷酸指导的效应蛋白/靶多核苷酸复合物从所述表面释放；(v)使所述指导多核苷酸/多核苷酸指导的效应蛋白/靶多核苷酸复合物与结合有第二捕获寡核苷酸的珠粒接触，所述第二捕获寡核苷酸包含与所述第二末端延伸部分互补的序列，使得所述指导多核苷酸/多核苷酸指导的效应蛋白/靶多核苷酸复合物与所述珠粒结合；并且任选地(vi)将所述珠粒递送到所述跨膜孔。22.根据权利要求14至20中任一项所述的方法，其进一步包含洗掉未与所述膜和/或珠粒偶联的指导多核苷酸、多核苷酸指导的效应蛋白和/或多核苷酸的步骤。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸包含前导序列。24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述指导多核苷酸具有与其连接的衔接子，任选地其中所述衔接子包含条形码和/或前导序列。25.根据权利要求23或24所述的方法，其中多核苷酸结合蛋白与所述前导序列连接。26.根据权利要求21至25中任一项所述的方法，其中步骤(d)包含监测由所述衔接子、所述靶多核苷酸或所述指导多核苷酸通过所述孔的易位引起的效应。27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)包含使所述样品和跨膜孔与以下各者接触：(a)第一指导多核苷酸和第一多核苷酸指导的效应蛋白，其中所述第一指导多核苷酸与所述靶多核苷酸中的第一序列结合并且具有与其连接的衔接子；以及(b)第二指导多核苷酸和第二多核苷酸指导的效应蛋白，其中所述第二指导多核苷酸与所述靶多核苷酸中的第二序列结合并且所述第二指导多核苷酸或所述第二多核苷酸指导的效应蛋白具有能够与其所连接的表面偶联的锚。28.根据权利要求27所述的方法，其中：(i)所述第一和第二多核苷酸指导的效应蛋白相同并且所述第二多核苷酸指导的效应蛋白未连接有锚；或(ii)所述第一和第二多核苷酸指导的效应蛋白是不同的RNA指导的效应蛋白。29.根据权利要求27或28所述的方法，其包含检测所述衔接子与所述跨膜孔的相互作用。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述衔接子包含条形码。31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中步骤(a)包含使所述样品与两个或更多个第一指导多核苷酸接触，其中所述两个或更多个第一指导多核苷酸与不同的多核苷酸序列结合。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述两个或更多个第一指导多核苷酸复合物上的所述衔接子包含不同的条形码。33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述不同的多核苷酸序列在同一个靶多核苷酸内或是可以存在于所述靶多核苷酸中的替代序列。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述替代序列包含SNP。35.根据权利要求27至34中任一项所述的方法，其中步骤(a)包含使所述样品与两个或更多个第二指导多核苷酸/多核苷酸指导的效应蛋白复合物接触，其中所述两个或更多个第二指导多核苷酸与不同的多核苷酸序列结合。36.根据权利要求31、32或35所述的方法，其中所述不同的靶序列存在于不同的靶多核苷酸中。37.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述样品包含连接有多核苷酸结合蛋白的多核苷酸。38.根据权利要求37所述的方法，其在步骤(c)之前包含使所述多核苷酸结合蛋白沿着所述多核苷酸移动的步骤，其中当所述多核苷酸结合蛋白到达与所述靶多核苷酸结合的指导多核苷酸/多...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德鲁·约翰·赫伦，詹姆斯·爱德华·格拉哈姆，理查德·亚历山大·古铁雷斯，瑞贝卡·维多利亚·鲍恩，詹姆斯·怀特，克莱夫·加文·布朗，丹尼尔·乔治·福德姆，
申请(专利权)人：牛津纳米孔技术公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB