基于DNA和RNA基因突变检测的高通量方法技术

本发明专利技术公开基于DNA和RNA基因突变检测的高通量方法，其包括(1)利用试剂由从受试者采集的生物样品中提取脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，基于脱氧核糖核酸构建DNA文库；对于核糖核酸，先逆转录成双链cDNA，然后构建成为RNA文库。(2)使第一探针组与DNA文库混合，同时使第二探针组与RNA文库混合。(3)利用第一探针组和第二探针组中的标志物从步骤(2)的混合物中分离得到探针与核酸的复合体；(4)利用高通量技术对复合体中靶标核酸进行测序。本发明专利技术采用基于NGS的方法学并对其进行优化，进一步提升检测的特异性和灵敏度。另外，通过针对RNA的检测还可以对DNA的检测结果进行验证。

High throughput method based on DNA and RNA gene mutation detection

【技术实现步骤摘要】
基于DNA和RNA基因突变检测的高通量方法
本专利技术涉及基因检测，具体涉及基于DNA+RNA基因突变检测的高通量方法。
技术介绍
肿瘤等疾病往往伴有多种体细胞突变，这些突变被用于肿瘤监测、预后等生物指标，或靶向药物的靶点以及反应性标志。肿瘤基因突变类型包括点突变、插入、缺失、基因重排、拷贝数异常等广义的基因突变。目前常见的肿瘤体细胞检测方案是DNA靶向测序或DNA靶向测序结合荧光定量PCR(qPCR)、荧光原位杂交(FISH)等其他辅助手段来进行融合检测。在检测体细胞变异时，研究人员目前大多选择靶向测序方案，明显缩小了测序的成本，也减轻了数据分析的负担。但目前针对体细胞变异中的融合检测，因为融合基因的断点一般都在内含子区域内，内含子一般比较长且包含不适合探针设计的区域，如简单，串联重复序列，转座子等，如果单独检测DNA，探针的设计会比较困难并会影响到捕获效率，同时考虑到融合基因在总DNA样品的丰度和背景基因组的比例偏低，会导致检出率偏低或漏检风险。同时对测序深度的要求也使得检测费用偏高，分析难度也比较大。
技术实现思路
本专利技术通过针对目标基因设计针对DNA部分的探针和针对RNA部分的探针，形成两个探针组。对生物样品进行DNA、RNA的共提取或分别提取，并分别测定DNA、RNA的含量和比例，共同建库或分别建库再按照比例混合，针对靶基因进行探针设计，优化并调整DNA和RNA捕获的探针组以及特定区域探针比例，并进行共同捕获后上机测序。由此解决了现有技术中的至少部分技术问题。另外，本专利技术使用RNA并行做捕获检测，设计相对简化，找出异常的外显子拼接组合，同时异常融合转录本的表达丰度较高会大大提高检出的概率。本专利技术提供基于DNA+RNA基因突变检测的高通量方法，其对NGS的方法学进行优化，进一步提升检测的特异性和灵敏度。具体地，本专利技术包括以下内容。一种基于DNA+RNA基因突变检测的高通量方法，其包括至少以下步骤：(1)利用试剂从受试者采集的生物样品中提取脱氧核糖核酸和核糖核酸，基于所述脱氧核糖核酸构建DNA文库，并基于所述核糖核酸构建RNA文库；(2)使第一探针组与所述DNA文库在适于核酸结合的条件下混合，使第二探针组与所述RNA文库在适于核酸结合的条件下混合，同时调整第一探针组的量和/或第二探针组的量或两者的比例，其中，所述第一探针组为针对第一目标基因信息的至少一种探针，所述第二探针组为针对第二目标基因信息的至少一种探针；(3)利用第一探针组和第二探针组中的标志物从步骤(2)的混合物中分离得到探针与核酸的复合体；和(4)利用高通量技术对所述复合体中的靶标核酸进行测序。在某些实施方案中，所述生物样品包括选自体液、组织液和细胞或细胞群组成的组中的至少一种。在某些实施方案中，步骤(1)中从同一生物样品同时提取脱氧核糖核酸和核糖核酸，得到总核酸，并且利用所述总核酸构建得到DNA和RNA混合文库。在某些实施方案中，步骤(1)中从第一生物样品提取脱氧核糖核酸和从第二生物样品提取核糖核酸，并且以单独分开的形式进行所述DNA文库的构建和所述RNA文库的构建；其中，第一生物样品和第二生物样品为相同样品类型的不同等份，或来自不同类型的生物样品。在某些实施方案中，本专利技术的方法进一步包括在步骤(2)之前使所述DNA文库和所述RNA文库混合得到DNA和RNA混合文库。在某些实施方案中，步骤(2)包括将第一探针组和第二探针组的混合物添加至DNA和RNA混合文库。在某些实施方案中，所述第一目标基因信息包括选自单核酸突变、缺失突变和拷贝数变异中的至少一种，和/或所述第二目标基因信息包括选自基因融合、外显子跳跃和基因表达量组成的组中的至少一种。在某些实施方案中，本专利技术的方法进一步包括根据脱氧核糖核酸的量和/或核糖核酸的量或两者的比例调整第一探针组的量和/或第二探针组的量或两者的比例的步骤。在某些实施方案中，第一目标基因和第二目标基因分别为作为疾病标志物的基因或靶向用药相关基因。在某些实施方案中，所述高通量技术为NGS技术。本专利技术的方法可用于肿瘤体细胞突变检测，例如用于肿瘤诊疗相关的分子检测，以寻找与肿瘤临床诊疗相关的突变基因的改变。需要说明的是，肿瘤体细胞的突变是研究肿瘤的重要信息，基于这些信息不能必然得到疾病状况，也不会直接诊断疾病。本专利技术的方法融合了现有检测的流程，无需再通过TargetDNA-Seq+TargetRNA-Seq两套NGS流程，或者TargetDNA-Seq+qPCR/FISH两个平台的流程进行基因突变检测，简化并缩短总检测流程和周期。融合部分RNA探针设计上对于提高检出率和捕获效率更有优势，具有更好的覆盖度：以ROS1基因为例，常发生融合区域为chr6：117641031-117658503，区域大小17472个碱基，若基于DNA设计探针，其中8375个碱基区域不适合设计探针，因为处于高度同源或高度重复的内含子区域，强行设计探针会影响整体的捕获效率，故覆盖度为52％。而基于mRNA设计则没有覆盖不全的问题，覆盖度100％。部分DNA水平融合基因检测区域存在重复序列，也直接影响到NGS测序生信分析和准确定位，这些问题都可以通过RNA水平的融合断点检出而得到更好的解决方案。本专利技术的方法更经济。以ROS1基因为例，基于DNA设计探针，除去不适合设计探针的区域，探针条数为76条，而基于mRNA设计探针仅需11条探针；通过调整不同探针覆盖区域间的组合，设计覆盖结合区的探针，进一步提高捕获特异性和效率。本专利技术的方法具有更好的融合检出率。更好的覆盖度带来更好的融合检出，同时由于发生融合后基因会出现高表达，在mRNA层面上更易被检出。在DNA样品检出率偏低的情况下，基于RNA水平的融合检出成为有效补充。附图说明图1为本专利技术一种示例性流程图。具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”或“量”均为基于重量的百分数。现在常用的肿瘤体细胞突变检测方法包括单独用DNA进行检测的方法，或DNA靶向测序+qPCR或FISH的方法等。其中第一种方法的检测结果不够准确，而第二种方法的检测流程多样化不够统一。另外，还包括RNA-Seq测序的方法，该方法得到的数据量较大。为了统一检测流程并且提高检测结果的准确性，本专利技术提供一种基于DNA和RNA共同进行肿瘤基因突变检测的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于DNA+RNA基因突变检测的高通量方法，其特征在于，包括至少以下步骤：(1)利用试剂由从受试者采集的生物样品中提取脱氧核糖核酸和核糖核酸，基于所述脱氧核糖核酸构建DNA文库，并基于所述核糖核酸构建RNA文库；(2)使第一探针组与所述DNA文库在适于核酸结合的条件下混合，使第二探针组与所述RNA文库在适于核酸结合的条件下混合，同时调整第一探针组的量和/或第二探针组的量或两者的比例，其中，所述第一探针组为针对第一目标基因信息的至少一种探针，所述第二探针组为针对第二目标基因信息的至少一种探针；(3)利用第一探针组和第二探针组中的标志物从步骤(2)的混合物中分离得到探针与核酸的复合体；和(4)利用高通量技术对所述复合体中的靶标核酸进行测序。

【技术特征摘要】
2019.04.22 CN 20191032269961.一种基于DNA+RNA基因突变检测的高通量方法，其特征在于，包括至少以下步骤：(1)利用试剂由从受试者采集的生物样品中提取脱氧核糖核酸和核糖核酸，基于所述脱氧核糖核酸构建DNA文库，并基于所述核糖核酸构建RNA文库；(2)使第一探针组与所述DNA文库在适于核酸结合的条件下混合，使第二探针组与所述RNA文库在适于核酸结合的条件下混合，同时调整第一探针组的量和/或第二探针组的量或两者的比例，其中，所述第一探针组为针对第一目标基因信息的至少一种探针，所述第二探针组为针对第二目标基因信息的至少一种探针；(3)利用第一探针组和第二探针组中的标志物从步骤(2)的混合物中分离得到探针与核酸的复合体；和(4)利用高通量技术对所述复合体中的靶标核酸进行测序。2.根据权利要求1所述的基于DNA+RNA基因突变检测的高通量方法，其特征在于，所述生物样品包括选自体液、组织液和细胞或细胞群组成的组中的至少一种。3.根据权利要求1所述的基于DNA+RNA基因突变检测的高通量方法，其特征在于，步骤(1)中从同一生物样品同时提取脱氧核糖核酸和核糖核酸，得到总核酸，并且利用所述总核酸构建得到DNA和RNA混合文库。4.根据权利要求1所述的基于DNA+RNA基因突变检测的高通量方法，其特征在于，步骤(1)中从第一生物样品提取脱氧核糖核酸和从第二生物样品提...

【专利技术属性】
技术研发人员：田埂，孙雪，王伟伟，张海鹏，
申请(专利权)人：元码基因科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32