一种检测样本微卫星不稳定性的试剂及其方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种检测样本微卫星不稳定性的试剂及其方法和应用，涉及二代测序体外诊断领域。本申请优选了50个分辨率高的目标MSI位点组合，该位点组合有利于快速、精准地实现样本微卫星不稳定性的检测。针对上述50个目标MSI位点组合，本申请还设计了检测引物对，在引物设计时将微卫星位点的重复序列分别至于扩增产物的上中下游，以平衡测序时的碱基比例，有效避免了因为重复序列区域碱基多态性低导致的测序低质量和有效数据低的问题。本申请用于检测目标MSI位点组合的引物对能同时进行多重PCR扩增，在降低检测成本的基础上，提高了检测效率，且检测准确率高。且检测准确率高。且检测准确率高。

【技术实现步骤摘要】
一种检测样本微卫星不稳定性的试剂及其方法和应用


[0001]本专利技术涉及二代测序体外诊断领域，具体而言，涉及一种检测样本微卫星不稳定性的试剂及其方法和应用。

技术介绍

[0002]微卫星(Microsatellite)序列是遍布于人类基因组上数百万个基因座(loci)中的短串联重复(short tandem repeats，STR)序列。通常由1
‑
6个重复(如单核苷酸、双核苷酸重复等)的碱基串联重复排列10
‑
50次。微卫星不稳定(MSI/MSI
‑
H)是由于DNA复制时错配修复(MMR)基因的功能缺陷，导致串联序列发生插入和缺失突变，引起MS序列长度改变的现象。这种类型的体细胞突变会导致抑癌基因失活或破坏其他非编码调控序列，从而起到致癌作用。MSI作为一种独特的分子表型，存在于多种癌症中，包括结直肠癌，子宫内膜癌，胃癌，前列腺癌，卵巢癌和成胶质细胞瘤等，并且MSI能够预测免疫检查点封锁疗法在实体瘤中的疗效。因此，检测MSI状态在肿瘤临床诊断和预后治疗上具有重要意义。
[0003]目前，基于NGS测序平台的MSI检测技术包括全基因组测序(WGS)，全外显子测序(WES)和多基因靶向区域测序。微卫星序列是遍布于人类基因组上的短串联重复序列，大部分分布于内含子区域。人类基因组数据量庞大，需要较大的测序数据量和一定的测序深度才能满足MSI检测的准确性。现有的检测方法存在检测成本高、操作复杂和检测准确性待提高等问题。比如，使用WGS测序检测MSI则存在测序成本偏高以及如果不能达到足够的测序深度所导致的检测结果不准确等缺点。WES测序涉及基因组蛋白质编码区域的测序，占全基因组的比例不超过2％，但是基于微卫星序列在基因组上的分布，只有很少的微卫星短串联重复序列分布在外显子区，因此，WES测序检测MSI则具有检测位点少而导致检测结果不准确的可能性。多基因靶向区域测序，如杂交捕获是针对多个微卫星位点的短串联重复序列设计探针，然后与基因组DNA进行杂交和富集，再进行NGS测序检测MSI状态。通常，定制的探针的长度为120nt，而且每条探针需要添加生物素进行标记。虽然杂交捕获技术能同时检测多个MSI位点，但是也需要一次合成多条探针进行实验，导致了实验成本的增加，同时对重复序列区域的捕获探针设计也会增加捕获脱靶率和降低整体捕获效率。其次，杂交捕获实验的步骤较多，操作复杂，而且对实验人员要求高。
[0004]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种检测样本微卫星不稳定性的试剂及其方法和应用。
[0006]本专利技术是这样实现的：
[0007]第一方面，本专利技术实施例提供了核酸组合物在制备用于检测样本微卫星不稳定性的产品中的应用，所述核酸组合物包括：检测表1所示的目标MSI位点的引物对；
[0008]表1目标MSI位点
[0009][0010][0011]备注：以hg19基因组为参照。
[0012]第二方面，本专利技术实施例提供了一种试剂或试剂盒，其包括：前述实施例所述的核酸组合物。
[0013]第三方面，本专利技术实施例提供了一种检测样本微卫星不稳定性的方法，其包括：采用前述实施例所述的核酸组合物或前述实施例所述的试剂或试剂盒对样本进行PCR扩增，建库获得样本文库，对所述样本文库进行测序获得测序数据，基于测序数据对样本的微卫
星不稳定性进行判读。
[0014]本专利技术具有以下有益效果：
[0015]本专利技术提供的50个目标MSI位点组合的分辨率高，有利于快速、精准地实现样本微卫星不稳定性的检测；
[0016]本专利技术针对上述50个目标MSI位点组合设计了检测引物对，由于微卫星位点的重复序列中A和T碱基较多，本申请在引物设计时将微卫星位点的重复序列分别至于扩增产物的上中下游，以平衡测序时的碱基比例，有效避免了因为重复序列区域碱基多态性低导致的测序低质量和有效数据低的问题；
[0017]本专利技术用于检测目标MSI位点组合的引物对能同时进行多重PCR扩增，在降低检测成本的基础上，提高了检测效率，且检测准确率高。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0019]图1为扩增子均一性箱型图；
[0020]图2为扩增子均一性箱型图(按非Touche Down/Touch down)；
[0021]图3为4
‑
20μM接头加入量对应的文库的质检结果；
[0022]图4为4
‑
15μM接头加入量对应的文库的质检结果；
[0023]图5为4
‑
10μM接头加入量对应的文库的质检结果；
[0024]图6为4
‑
5μM接头加入量对应的文库的质检结果；
[0025]图7为4
‑
2μM接头加入量对应的文库的质检结果；
[0026]图8为72
‑
20μM接头加入量对应的文库的质检结果；
[0027]图9为72
‑
15μM接头加入量对应的文库的质检结果；
[0028]图10为72
‑
10μM接头加入量对应的文库的质检结果；
[0029]图11为72
‑
5μM接头加入量对应的文库的质检结果；
[0030]图12为72
‑
2μM接头加入量对应的文库的质检结果。
具体实施方式
[0031]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0032]本申请提供了一种多重扩增反应体系结合直接测序接头连接建库的实验方法，应用于肿瘤样本的MSI检测。所述肿瘤样本可选自：结直肠癌的FFPE样本和新鲜组织样本中的任意一种或多种。
[0033]本专利技术实施例提供了核酸组合物在制备用于检测样本微卫星不稳定性的产品中的应用，其包括：检测表1所示的目标MSI位点的引物对。
[0034]经一系列创造性劳动，专利技术人初步筛选得到由多个微卫星位点组成的候选位点集和，并分析各微卫星位点与在样本集的已知微卫星状态的一致性，当某个位点微卫星状态和样本的微卫星状态一致时，则该位点加1分，不一致扣1分，最后计算样本集中对应微卫星位点的总得分作为贡献度，且所述样本MSI评分＝不稳定位点数/总位点数，当样本MSI评分在规定阈值以上时，则将对应的样本定义为MSI
‑
H，否则将对应的样本定义为MSS，计算候选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.核酸组合物在制备用于检测样本微卫星不稳定性的产品中的应用，其特征在于，所述核酸组合物包括：检测以下目标MSI位点的引物对：
以hg19基因组为参照。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测目标MSI位点的引物对包括：引物对1～50中的至少一对，引物对1～50的序列如SEQ ID No:1～100所示。3.一种试剂或试剂盒，其特征在于，其包括：权利要求1～2任一项所述的核酸组合物。4.根据权利要求3所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒还包括：PCR检测试剂、末端修复试剂和接头连接试剂中的至少一种。5.根据权利要求4所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂包括：dNTP、DNA聚合酶、Mg
2+
和无核酸酶水中的至少一种；优选地，所述DNA聚合酶包括：Enzymatics聚合酶、KAPA聚合酶和Vazyme聚合酶中的任意一种；优选地，所述DNA聚合酶包括：KAPA聚合酶和Vazyme聚合酶中的任意一种；优选地，所述末端修复试剂包括：末端修复缓冲液、末端修复酶、和无核酸酶水中的至少一种；优选地，所述接头连接试剂包括：末端修复反应混合液、接头连接缓冲液、接头连接酶和接头中的至少一种。6.一种检测样本微卫星不稳定性的方法，其特征在于，其包括：采用权利要求1～2任一项所述的核酸组合物或权利要求3～5任一项所述的试剂或试剂盒对样本进行PCR扩增，建库获得样本文库，对所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁壮仙，李晓爽，王伟伟，杨洲，倪守峰，田子沫，赵玥，封彦杰，张吉娜，张美俊，田埂，
申请(专利权)人：元码基因科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：