基于外周血血浆游离DNA高通量测序技术的肿瘤筛查试剂盒及其系统与方法技术方案

本发明专利技术公开了一种基于外周血血浆游离DNA高通量测序技术的肿瘤筛查试剂盒及其系统与方法；旨在提供一种采用外周血，实现高灵敏度、非突变位点和特定基因依赖、单一或多种肿瘤的早期筛查的试剂盒，该试剂盒包括：血浆游离DNA提取试剂、文库构建试剂、测序试剂、测序芯片，生物信息分析方法；通过对健康人与肿瘤患者外周血血浆游离DNA进行高通量测序，再经过测序数据的生物信息学分析获得游离DNA在全基因组范围内的核小体足迹定位信息及差异，进而根据核小体足迹差异实现肿瘤患者和健康对照人群的聚类分析，区分肿瘤患者和健康对照人群；上述筛查目的是获得中间结果的信息；属于生物技术领域。

Tumor screening kit based on high-throughput sequencing of free DNA in peripheral blood plasma and its system and method

【技术实现步骤摘要】
基于外周血血浆游离DNA高通量测序技术的肿瘤筛查试剂盒及其系统与方法
本专利技术公开了一种肿瘤筛查试剂盒，具体地说，是一种基于外周血血浆游离DNA高通量测序技术的肿瘤筛查试剂盒，本专利技术还公开了基于外周血血浆游离DNA高通量测序技术的肿瘤筛查试剂盒的方法。
技术介绍
世界卫生组织癌症研究数据显示：2018年全球估计有1800万新增癌症病例以及960万癌症死亡病例。同时世界卫生组织提出只要早期发现，90％的癌症完全可以治愈。但我国各地医院的癌症首诊病人却仅占10％以下，90％以上都失去了获得良好疗效的宝贵时机。早期癌症一般没有明显症状，而当身体感觉到明显不适从而进行检测时一般都到了癌症的中晚期，因而癌症的早期筛查非常重要。目前肿瘤检查的主要方法有影像学、组织活检、血清学、液体活检等方法。影像学筛查法主要基于CT、B超、钼靶、胃肠镜等影像学仪器进行检测，其检出时间的下限为已经产生一定大小的病变肿瘤组织块，其检测结果准确性和特异性均较好，可以作为诊断的金标准，但胃镜、肠镜令人疼痛难忍，给患者身心造成负担，不适合大规模的筛查；组织活检主要针对实体瘤，常规检查的样本来源于肿瘤组织，但由于肿瘤的异质性，组织活检本身存在许多局限性，比如取样创伤性大、不适宜多次连续取样、仅反应肿瘤过程的静态信息，不能动态检测等；血清学筛查法主要是基于AFP、CEA等多种血清标志物，但血清标志物假阳性高，检测效率低；基于外周血的液体活检因其方便、快捷、无创、特异、全面和便于实时监测等有点，成为肿瘤领域的研究热点。目前的基础和临床研究中，液体活检的标志物主要包括循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环肿瘤细胞(CTC)、循环RNA及外泌体等。美国的约翰斯·霍普金斯大学研发了一种CancerSEEK的液体活检技术采用16种肿瘤相关基因和8个肿瘤特异性蛋白，用计算机算法对结果进行分析。美国加州大学戴维斯分校综合癌症中心和基因泰克公司联合研究证实血浆中肿瘤突变负荷(bTMB)能够作为Tecentriq免疫治疗的潜在非侵入性生物标志。英国剑桥大学科学家NitzanRosenfeld及其团队发现血液中循环肿瘤DNA和非肿瘤DNA片段的长度分布特征，不同细胞释放的游离DNA的长度是不同的，这种片段长度的差异可以作为辨别肿瘤细胞和非肿瘤细胞的重要手段。现有研究表明液体活检具有肿瘤早期筛查的潜力，但目前的基础及临床研究方法都具有基因或位点依赖性，多能用于单一癌症的筛查。外周血血浆游离DNA又称cfDNA(cellfreeDNA)，是指外周血中游离于细胞外的DNA，主要来源于正常细胞、异常细胞(包括肿瘤细胞)或者外源的微生物(如病毒DNA)，具体包括自身正常细胞代谢的凋亡小体、肿瘤细胞碎片、外泌体等。细胞死亡或者快速分裂时，会释放游离的DNA进入外周血，主要分布于血浆和血清中。在正常人中，游离DNA主要来源于造血细胞。由于细胞坏死或者细胞更新速度变快，感染、缺血、肿瘤、自身免疫性疾病、肥胖和怀孕时，体内游离DNA含量会增加。血浆游离DNA是细胞死亡后，染色质经酶切片段化后形成DNA片段，其半衰期很短，半小时就会被清除。游离DNA包括核小体解离而产生的裸露DNA和核小体固定的蛋白DNA复合体两种情形。其中被核小体固定的DNA序列因核小体保护而降解速度较慢，而裸露的DNA序列很快被降解，所以游离DNA长度一般为核小体固定长度的整数倍。正常人体外周血血浆DNA与肿瘤患者外周血血浆游离DNA，以及不同类型的肿瘤患者外周血血浆游离DNA中的核小体足迹是存在差异的。可以通过高通量测序技术对血浆cfDNA进行全基因组测序，通过生物信息学分析获得核小体足迹定位信息，再通过核小体足迹定位信息在正常对照人群和肿瘤患者中的差异信息进行聚类分析，实现对于单一类型肿瘤或多种类型肿瘤的无创筛查，该方法避免了现有液体活检技术的基因或位点依赖性，并可同时用于多种肿瘤的筛查。
技术实现思路
针对上述不足，本专利技术的第一个目的是提供一种采用外周血，实现高灵敏度、非突变位点和特定基因依赖、单一或多种肿瘤的早期筛查的试剂盒。本专利技术的第二个目的是提供上述试剂盒的筛查系统。本专利技术的第三个目的是提供上述试剂盒的筛查方法。为此，本专利技术提供的第一个技术方案是这样的：一种基于外周血血浆游离DNA高通量测序技术的肿瘤早期筛查试剂盒，包括血浆游离DNA提取试剂、文库构建试剂、测序试剂、测序芯片，生物信息分析方法说明。进一步的，上述的基于外周血血浆游离DNA高通量测序技术的肿瘤筛查试剂盒，所述的文库构建试剂包括末端修复、接头连接、PCR扩增试剂。进一步的，上述的基于外周血血浆游离DNA高通量测序技术的肿瘤筛查试剂盒，该试剂盒用于单一类型肿瘤或者多种类型肿瘤的无创筛查。进一步的，上述的基于外周血血浆游离DNA高通量测序技术的肿瘤筛查试剂盒，所述的肿瘤包括乳腺癌、肺癌、肠癌。本专利技术提供的第二个技术方案是：一种基于外周血血浆游离DNA高通量测序技术的肿瘤早筛系统，其特征在于：该系统包括：(1)核小体信息模块：所述核小体信息模块用于注释UCSC的RefSeq数据库中所有人类蛋白编码基因信息，获取每个基因的转录起始位点(TSSs)和转录终止位点(TTSs)上下游1Kb区域的基因组位置，构建核小体定位标准数据库；(2)测序模块：所述测序模块用于检查者外周血血浆游离DNA进行高通量测序，获取各检查者序列在基因组上的位置信息；(3)质控模块：所述质控模块用于根据核小体足迹定位的比对结果，去除由文库构建和高通量测序引起的PCR重复序列，去除低质量DNA片段序列、去除未比对到核小体足迹定位区域且在基因组中唯一比对的DNA片段序列，得到RPKM方法标准化后的值；(4)分析模块：所述分析模块用于筛选核小体区域存在差异的基因，利用秩和检验非参数方法，并通过P值校正，得到两组间的变化倍数|log2foldchange|>1且q-value值<0.1的差异基因转录起始位点(TSSs)和转录终止位点(TTSs)区域；(5)聚类模块：所述聚类模块用于区分健康人群和肿瘤患者，根据Cluster软件对基因转录起始位点(TSSs)和转录终止位点(TTSs)区域覆盖度数据进行标准化后的等级聚类及R语言pheatmap包对数据的可视化结果，根据全基因组范围内TSSs区核小体的印记差异，将样品聚类为健康人、乳腺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌。本专利技术提供的第三个技术方案是这样的：一种基于外周血血浆游离DNA高通量测序技术的肿瘤筛查方法，通过对健康人体外周血血浆DNA与肿瘤病人外周血血浆游离DNA进行高通量测序，再经过测序数据的生物信息学分析获得游离DNA在全基因组范围内的核小体足迹定位信息及差异，进而根据核小体足迹差异实现肿瘤患者和健康对照人群的聚类分析，区分肿瘤患者和健康对照人群；上述筛查目的是获得中间结果的信息。进一步的，上述的基于外周血血浆游离DNA高通量测序技术的肿瘤筛查方法，所述的核小体足迹差异差异是外周血血浆游离DNA全基因组范围内每个基因转录起始位点TSSs区域的核小体分布与该基因其余区域的差异。进一步的，上述的基于外周血血浆游离DNA高通量测序技术的肿瘤筛查方法，具体包括以下步骤：(1)将健康人及肿瘤患者的外周血血浆进行血浆分离和游离DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于外周血血浆游离DNA高通量测序技术的肿瘤筛查试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括血浆游离DNA提取试剂、文库构建试剂、测序试剂、测序芯片。

【技术特征摘要】
1.一种基于外周血血浆游离DNA高通量测序技术的肿瘤筛查试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括血浆游离DNA提取试剂、文库构建试剂、测序试剂、测序芯片。2.根据权利要求1所述的基于外周血血浆游离DNA高通量测序技术的肿瘤筛查试剂盒，其特征在于，还包括生物信息分析方法说明。3.根据权利要求1所述的基于外周血血浆游离DNA高通量测序技术的肿瘤筛查试剂盒，其特征在于，所述的文库构建试剂包括末端修复、接头连接、PCR扩增试剂。4.根据权利要求1所述的基于外周血血浆游离DNA高通量测序技术的肿瘤筛查试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于单一类型肿瘤或者多种类型肿瘤的无创筛查。5.根据权利要求1所述的基于外周血血浆游离DNA高通量测序技术的肿瘤筛查试剂盒，其特征在于，所述的肿瘤包括乳腺癌、肺癌、肠癌。6.一种基于外周血血浆游离DNA高通量测序技术的肿瘤早筛系统，其特征在于：该系统包括：(1)核小体信息模块：所述核小体信息模块用于注释UCSC的RefSeq数据库中所有人类蛋白编码基因信息，获取每个基因的转录起始位点(TSSs)和转录终止位点(TTSs)上下游1Kb区域的基因组位置，构建核小体定位标准数据库；(2)测序模块：所述测序模块用于检查者外周血血浆游离DNA进行高通量测序，获取各检查者序列在基因组上的位置信息；(3)质控模块：所述质控模块用于根据核小体足迹定位的比对结果，去除由文库构建和高通量测序引起的PCR重复序列，去除低质量DNA片段序列、去除未比对到核小体足迹定位区域且在基因组中唯一比对的DNA片段序列，得到RPKM方法标准化后的值；(4)分析模块：所述分析模块用于筛选核小体区域存在差异的基因，利用秩和检验非参数方法，并通过P值校正，得到两组间的变化倍数|log2foldchange|>1且q-value值<0.1的差异基因转录起始位点(TSSs)和转录终止位点(TTSs)区域；(5)聚类模块：所述聚类模块用于区分健康人群和肿瘤患者，根据Cluster软件对基因转录起始位点(TSSs)和转录终止位点(TTSs)区域覆盖度数据进行标准化后的等级聚类及R语言pheatmap包对数据的可视化结果，根据全基因组范围内TSSs区核小体的印记差异，将样品聚类为健康人、乳腺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌。7.一种基于外周血血浆游离DNA高通量测序技术的肿瘤筛查方法，其特征在于，通过对健康人体外周血血浆DNA与肿瘤病人外周血血浆游离DNA进行高通量测序，再经...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥顺，李坤，杨学习，
申请(专利权)人：广州市雄基生物信息技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44