一种基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒制造技术

本实用新型专利技术涉及一种基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒，包括盒体、盒盖和内衬，该盒体内设置核酸提取试剂存放腔、PCR反应体系存放腔和PCR产物纯化试剂存放腔，在盒体与各存放腔之间均填充所述内衬，核酸提取试剂存放腔内至少放置溶菌酶管、十二烷基硫酸钠溶液管、十六烷基三甲基溴化铵管，PCR产物纯化试剂存放腔内至少放置TE缓冲液管、乙酸钠溶液管和乙二胺四乙酸钠溶液管，该试剂盒还可选择地设置冷藏存放腔和备用存放腔。本实用新型专利技术所述的试剂盒可用于细菌污染物从分离纯化到核酸测序前的全部操作过程，实现细菌污染物的快速、一体化鉴定；本实用新型专利技术构建的标准核酸序列数据库，可为细菌核酸测序鉴定方法提供客观、准确的判定依据。

A Kit for Bacterial Identification Based on DNA Characteristic Sequence

【技术实现步骤摘要】
一种基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒
本技术涉及核酸测序鉴定领域，尤其涉及一种基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒。
技术介绍
利用分子生物学技术对药物原料、辅料、制药用水、中间体、终产品和环境中的污染微生物进行鉴定、分类和追溯，是加强药品生产过程质量控制、提升产品质量与安全性、降低用药风险的有效手段。与传统的形态学观察、显微镜检、理化鉴别和生化分析等技术相比，分子生物学技术以生物核酸作为目标检测物，可以从根本性的遗传物质层面对菌株的种属及来源做出解释，检测结果更加准确，灵敏度更高，特异性更强，目前已逐渐成为国、内外药品质量标准发展的必然趋势。目前，《美国药典》(USP40<1113>)、《欧洲药典》(EP9.0<5.1.6>)、《日本药典》(JP17<GeneralInformationG4>)、《中国药典》(通则9204)中均收载了分子生物学技术用于药品微生物质量控制的相关章节。DNA特征序列(DNA条形码)分子鉴定是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的分子生物学分类方法。该方法以核酸测序技术为基础，通过筛选通用DNA特征序列，建立数据库和鉴定平台，运用生物信息学方法分析比对DNA数据，进而对物种进行鉴定，是对传统生物鉴定方法的有效补充和重大突破，近年来受到国内外药品质量标准制定机构的广泛关注，并逐渐成为物种鉴定和分类的研究热点。16SrRNA基因全长涵盖了最全面的菌株遗传进化信息，但受到核酸测序方法操作性、测序质量、测序成本、核酸测序反应长度、特别是高通量核酸测序反应读长的限制，多数文献报道还是采用部分核酸序列(PartialSequence)进行研究，具有鉴定和分类意义的核心区域尚待讨论。目前，以16SrRNA核酸测序技术为基础的微生物鉴定方法已经建立，并应用于临床分离菌株的研究，但其用于药品质量控制及药品生产环境中常见污染菌的鉴定还鲜有报道，且基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒的也鲜有报道。
技术实现思路
本技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，通过测定16S核糖体RNA基因5'端可变区的核酸序列进行菌株鉴定，提供一种基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒，并提供一种简便、快速、规范化的基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法。为了实现上述目的，本技术采取的技术方案包括：本技术的第一个目的是提供一种基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒，包括盒体、盒盖和内衬，所述盒体内设置核酸提取试剂存放腔、PCR反应体系存放腔和PCR产物纯化试剂存放腔，在所述盒体与各存放腔之间均填充所述内衬。为了进一步优化上述试剂盒，本技术采取的技术措施还包括：进一步地，所述核酸提取试剂存放腔内设置数个试管，所述试管至少包括溶菌酶管、十二烷基硫酸钠溶液管、十六烷基三甲基溴化铵管；更进一步地，所述试管还包括TE缓冲液管、氯化钠溶液管、饱和苯酚-氯仿-异戊醇溶液管、无水乙醇管、70％乙醇溶液管。进一步地，所述PCR反应体系存放腔内设置数个试管，所述试管至少包括引物管、DNA聚合酶管、PCR反应液管；其中，所述PCR反应液管内含有PCR缓冲液、镁离子溶液和脱氧核苷三磷酸。进一步地，所述PCR产物纯化试剂存放腔内设置数个试管，所述试管至少包括TE缓冲液管、乙酸钠溶液管和乙二胺四乙酸钠溶液管；更进一步地，所述试管还包括乙酸钠溶液管、无水乙醇管和75％乙醇溶液管。进一步地，所述盒体内还设置至少放置上样缓冲液试管的备用存放腔；更进一步地，所述备用存放腔内可放置各类规格的离心管、中间试剂存放管等。进一步地，所述盒体内还设置冷藏存放腔，所述冷藏存放腔与所述盒体为可拆卸安装；更进一步地，所述冷藏存放腔可直接抽出或放入所述盒体中，所述盒体和所述冷藏存放腔之间设置保冷材料。进一步地，所述冷藏存放腔包括冷藏外腔室和冷藏内腔室，所述冷藏内腔室用于放置含有需在低温条件下存放的试剂的试管，所述冷藏外腔室和冷藏内腔室之间为一密封的中空结构，其内置保冷剂。更进一步地，所述冷藏外腔室的内壁和所述冷藏内腔室的外壁均设置防水密封层，所述保冷剂包括凝胶或水中的一种；更进一步地，所述保冷剂还包括保冰介质和隔热颗粒，所述保冰介质为甲基纤维素或丙烯酸聚合物，所述隔热颗粒为保丽龙材料。进一步地，所述盒体上固定设置一卡扣件，所述盒盖设置一与所述卡扣件配合使用的凸块。进一步地，所述盒体及各存放腔的形状及尺寸根据各试管的形状及尺寸进行匹配设置。进一步地，所述盒盖的内部固定设置内衬。本技术的第二个目的是提供一种采用上述试剂盒的基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法，其包括如下步骤：步骤一、选取待鉴定的细菌菌株，并提取和纯化所述菌株的基因组DNA；步骤二、采用扩增引物PCR扩增步骤一中纯化后的基因组DNA的特征序列片段；步骤三、提取和纯化步骤二中获得的PCR扩增产物；步骤四、测定步骤二中纯化后的PCR扩增产物的序列，并采用通用性序列拼接软件，去除引物区，获得相应片段的DNA序列；步骤五、将步骤四所述的相应片段的DNA序列导入标准核酸序列数据库进行序列比对，进行细菌菌株的鉴定；其中，所述步骤一中，菌株的基因组DNA的提取和纯化采用溶菌酶(Lysozyme)、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵(CetyltriethylammnoniumBromide，CTAB)进行菌体破碎；采用苯酚-氯仿-异戊醇、乙醇沉淀核酸，获得符合质量控制要求的基因组DNA。其中，所述步骤一中，所述菌株的基因组DNA的提取和纯化的具体步骤包括：取适量分离纯化后的菌体置于离心管中，加入TE缓冲液、溶菌酶，混匀、水浴加热；加入十二烷基硫酸钠溶液，水浴加热；加入氯化钠溶液、十六烷基三甲基溴化铵溶液，水浴加热；加入饱和苯酚-氯仿-异戊醇溶液，剧烈震荡，室温静置、离心，取上清液置于新的离心管中，重复操作1次；加入无水乙醇，低温条件下静置，离心、弃去上清液；加入70％乙醇溶液洗涤，离心、弃去上清液，室温风干至乙醇挥发完全；加入TE缓冲液，混匀后作为核酸提取溶液。该步骤也可替换为：取适量分离纯化后的菌体置于离心管中，加入溶菌酶溶液，混匀、水浴加热；加入十二烷基硫酸钠溶液，水浴加热；加入氯化钠溶液、十六烷基三甲基溴化铵溶液，水浴加热；将菌体裂解液转移至适宜的载体上，通过离心的方式去除菌体及裂解液，将核酸截留在适宜的载体上，加入饱和苯酚-氯仿-异戊醇溶液，无水乙醇溶液等洗涤，离心、弃去洗涤液；室温风干至乙醇挥发完全；加入适宜的缓冲液溶解核酸，离心将其从适宜的载体上洗脱下来，作为核酸提取溶液。两种可替换的步骤中，所使用的试剂用量及浓度均相同。其中，步骤二中，所述扩增引物扩增16SrRNA中的V1～V3区片段的核酸序列，该扩增引物的序列如下所示：正向引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物：5'-GTATTACCGCGGCTGCTGGC-3'；所述PCR扩增反应体系以25μl为参照，包括：10×PCR缓冲液，25mmol/L镁离子溶液2.5μl，2.5mmol/LdNTPs2μl，10μmol/L引物对各0.5μl，模板DNA0.5μl，5U/μlTaqDNA聚合酶0.2μl，加无菌双蒸水至25μl；PCR扩增反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒，包括盒体(1)、盒盖(2)和内衬，其特征在于，所述盒体(1)内设置核酸提取试剂存放腔(4)、PCR反应体系存放腔(5)、PCR产物纯化试剂存放腔(6)，在所述盒体(1)与核酸提取试剂存放腔(4)、PCR反应体系存放腔(5)、PCR产物纯化试剂存放腔(6)之间均填充所述内衬。

【技术特征摘要】
1.一种基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒，包括盒体(1)、盒盖(2)和内衬，其特征在于，所述盒体(1)内设置核酸提取试剂存放腔(4)、PCR反应体系存放腔(5)、PCR产物纯化试剂存放腔(6)，在所述盒体(1)与核酸提取试剂存放腔(4)、PCR反应体系存放腔(5)、PCR产物纯化试剂存放腔(6)之间均填充所述内衬。2.根据权利要求1所述的一种基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂存放腔(4)内设置数个试管，所述试管至少包括溶菌酶管、十二烷基硫酸钠溶液管、十六烷基三甲基溴化铵管。3.根据权利要求1所述的一种基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系存放腔(5)内设置数个试管，所述试管至少包括引物管、DNA聚合酶管、PCR反应液管；其中，所述PCR反应液管内含有PCR缓冲液、镁离子溶液和脱氧核苷三磷酸。4.根据权利要求1所述的一种基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒，其特征在于，所述PCR产物纯化试剂存放腔(6)内设置数个试管，所述试管至少包括TE缓冲液管、乙酸钠溶液管和乙二胺四乙酸钠溶液管。5.根据权利要求1所述的一种基于DNA特征序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯震，蒋波，李芳，洪小栩，许华玉，秦峰，刘浩，杨美成，
申请(专利权)人：上海市食品药品检验所，
类型：新型
国别省市：上海,31