重组口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种重组口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和应用。具体地，本发明专利技术以口蹄疫病毒结构蛋白构成的不含病毒核酸的病毒样颗粒，该病毒样颗粒免疫动物，能激起机体产生针对口蹄疫的免疫保护，且不具有传染性，相比传统灭活病毒疫苗有着更高的安全性。本发明专利技术还提供了上述重组口蹄疫病毒样颗粒的制备方法。

Recombinant foot-and-mouth disease virus-like particles and their preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
重组口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和应用
本专利技术涉及基因工程和免疫领域，更具体地涉及一种重组口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和应用。
技术介绍
口蹄疫(Foot-and-mouthdisease，FMD)是由口蹄疫病毒所引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，该病毒传染性高且传播迅速。主要侵害偶蹄兽，偶见于人和其他动物。其临诊特征为口腔粘膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱。口蹄疫在世界范围内多有爆发，有强烈的传染性,一旦发病传播速度快,往往造成大流行,不易控制和消灭,带来严重的经济损失，被国际兽疫局(OIE)列为A类动物疫病名单之首,是世界各国检疫和防疫的重点对象。我国也将其列为第一类动物传染病的第一位。口蹄疫流行情况从过去的点发到现今的普发，从有季节性到无季节性。口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员，该病毒宿主范围广，遗传变异率高，抗原差异大，现存在七种血清型，0、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1，每种又有众多个不同的亚型，血清型间无交叉免疫现象。即使是免疫动物在接触新病毒后，也可形成隐性感染而持续带毒，在免疫和非免疫条件下病毒均可适应机体而长期存在。其中O型血清型最为常见，A型口蹄疫目前在我国只是零星散发。成年动物感染口蹄疫后大部分能康复，但有时幼畜病死率可达100％，能够造成感染动物相关的生产力下降，成为制约国际、国内动物和动物产品贸易的主要障碍。疫苗免疫是控制和预防口蹄疫流行的有效技术方法。目前市场上主要采用的疫苗是病毒灭活疫苗，该类口蹄疫疫苗存在以下缺点：(1)稳定性差，保护期短，防疫效果不理想；(2)制备过程中存在散毒的安全隐患，需要P3级安全防护，成本高、操作难；(3)制备过程中，非结构蛋白去除不彻底，会造成区分自然感染及免疫动物的困难；(4)灭活不彻底将存在安全性问题。因此，本领域迫切需要开发安全、高效、经济的新型口蹄疫疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型重组口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和应用。具体地，本专利技术的目的在于提供一种新型口蹄疫病毒样颗粒的基因序列及蛋白序列，并提供了该病毒样颗粒的制备方法，该病毒样颗粒应用于提高免疫动物对口蹄疫病毒的免疫保护力，降低动物口蹄疫的发病率。在本专利技术的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白从N端至C端具有式I结构：P1－2A－3C(I)式中，P1为口蹄疫病毒外壳结构蛋白VP元件，2A为非结构蛋白2A蛋白酶，3C为非结构蛋白3C蛋白酶，其中，所述P1-2A元件可在酶3C的酶切作用下，形成VP0蛋白、VP3蛋白和VP1蛋白。在另一优选例中，所述的融合蛋白可自剪切并释放出3C蛋白酶。在另一优选例中，所述的酶3C是源自所述融合蛋白的3C蛋白酶。在另一优选例中，所述的VP0蛋白、VP3蛋白和VP1蛋白可以自我组装成与天然口蹄疫病毒非常相似的VLP。在另一优选例中，所述非常相似是指所述VLP与天然口蹄疫病毒的相似度≥80％，较佳地，≥90％。在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:5-8所示，或者与SEQIDNO.:5-8所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)。在本专利技术的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本专利技术第一方面所述的融合蛋白。在另一优选例中，所述的多核苷酸是经密码子优化的多核苷酸。在另一优选例中，所述多核苷酸编码SEQIDNO.:5-8所示的多肽；并且所述多核苷酸选自下组：(a)序列如SEQIDNO.:1-4所示的多核苷酸；(b)核苷酸序列与SEQIDNO.:1-4所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；(c)如SEQIDNO.:1-4所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；(e)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。在本专利技术的第三方面，提供了一种基因工程细胞，所述基因工程细胞为真核细胞，并且所述细胞的基因组中整合有口蹄疫病毒外壳蛋白的表达盒；或者所述细胞中含有表达载体，所述表达载体含有所述口蹄疫病毒外壳蛋白的表达盒；其中，所述的表达盒可表达本专利技术第一方面所得的融合蛋白，并且所述基因工程细胞在胞内表达所述外壳蛋白，且所述外壳蛋白在所述基因工程细胞内部形成病毒样颗粒(VLPs)。在另一优选例中，所述的病毒样颗粒由VP0蛋白、VP3蛋白和VP1蛋白形成。在另一优选例中，所述病毒为口蹄疫病毒O型，较佳地为FMDVO/BY/CHA/2010株口蹄疫病毒、或OJMS株口蹄疫病毒。在另一优选例中，所述细胞为酵母细胞，优选为毕赤酵母细胞，更优选为毕赤酵母KM71菌株。在另一优选例中，VP0蛋白可以裂解为VP4蛋白和VP2蛋白。在另一优选例中，所述的表达盒包含外壳蛋白编码序列，并且，所述的外壳蛋白编码序列从5'至3'可操作地连接的以下元件：VP4蛋白的编码序列、VP2蛋白的编码序列、VP3蛋白的编码序列和VP1蛋白的编码序列2A非结构蛋白基因编码区序列、3C蛋白酶编码区序列。在另一优选例中，所述的表达盒的3'端还包含启动子。在另一优选例中，所述的表达盒不含有分泌表达元件。在另一优选例中，所述的表达盒不含有分泌肽、引导肽、或信号肽。在另一优选例中，所述表达载体以毕赤酵母ppIcx载体为骨架。在另一优选例中，所述3C蛋白酶包括突变的3C蛋白酶。在另一优选例中，所述3C蛋白酶的第38位的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)，且第48位的苯丙氨酸(F)突变为丝氨酸(S)。在另一优选例中，所述外壳蛋白在相对于SEQIDNO.:1的第791位的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)，且第801位的苯丙氨酸(F)突变为丝氨酸(S)。在另一优选例中，所述外壳蛋白在相对于SEQIDNO.:3的第791位的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)，且第801位的苯丙氨酸(F)突变为丝氨酸(S)。在本专利技术的第四方面，提供了一种病毒样颗粒(VLPs)，所述VLPs由本专利技术第三方面所述的基因工程细胞表达。在本专利技术的第五方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本专利技术第四方面所述的病毒样颗粒，和药学上可以接受的载体。在另一优选例中，所述药物组合物包括疫苗组合物。在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。在另一优选例中，所述的佐剂包括氧化铝、皂苷、quilA、胞壁酰二肽、矿物油或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、细胞因子(包括IL-1、IL-2、IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12、和CpG)。在本专利技术的第六方面，提供了一种制备VLPs的方法，包括步骤：在适合表达的条件下，培养本专利技术第三方面所述的细胞，从而表达出本专利技术第四方面所述的病毒样颗粒(VLPs)；和分离所述病毒样颗粒(VLPs)。在本专利技术的第七方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本专利技术第二方面所述的多核苷酸。在本专利技术的第八方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本专利技术第七方面所述的表达载体，或者在基因组中整合有本专利技术第二方面所述的多核苷酸。在本专利技术的第九方面，提供了一种检测试剂，所述的检测试剂含有本专利技术第四方面所述的病毒样颗粒(VLPs)，并且所述的病毒样颗粒偶联有本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白从N端至C端具有式I结构：P1－2A－3C  (I)式中，P1为口蹄疫病毒外壳结构蛋白VP元件，2A为非结构蛋白2A蛋白酶，3C为非结构蛋白3C蛋白酶，其中，所述P1‑2A元件可在3C蛋白酶的酶切作用下，形成VP0蛋白、VP3蛋白和VP1蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白从N端至C端具有式I结构：P1－2A－3C(I)式中，P1为口蹄疫病毒外壳结构蛋白VP元件，2A为非结构蛋白2A蛋白酶，3C为非结构蛋白3C蛋白酶，其中，所述P1-2A元件可在3C蛋白酶的酶切作用下，形成VP0蛋白、VP3蛋白和VP1蛋白。2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸是经密码子优化的多核苷酸。4.一种基因工程细胞，其特征在于，所述基因工程细胞为真核细胞，并且所述细胞的基因组中整合有口蹄疫病毒外壳蛋白的表达盒；或者所述细胞中含有表达载体，所述表达载体含有所述口蹄疫病毒外壳蛋白的表达盒；其中，所述的表达盒表达权利要求1所得的融合蛋白，并且所述基因工程细胞在胞内表达所述外壳蛋白，且所述外壳蛋白在所述基因工程细胞内...

【专利技术属性】
技术研发人员：楼觉人，
申请(专利权)人：楼觉人，
类型：发明
国别省市：上海,31