本发明专利技术涉及一种同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，属于人冠状病毒检测技术领域。所述人冠状病毒具体为MERS‑CoV/HCoV‑NL63/HCoV‑OC43/HCoV‑HKUI；所述检测试剂盒具体包括：特异性引物对和探针四组，阳性质控品和阴性质控品；所述每组异性引物对和探针均包括一对特异性引物对和一条探针序列；所述阳性质控品具体为一条人工合成的靶序列；阴性质控品为去离子水或无菌水。本发明专利技术试剂盒可单管实现同时检测四种人冠状病毒，不仅检测特异性强、检测灵敏度高，而且检测时间快，避免了逐个检测所带来的耗时长、检测成本高、容易交叉污染等缺点。目前市场上未见有类似相关产品报道，本发明专利技术试剂盒在疾病检测、传染病防控、指导临床治疗等方面具有广阔应用前景。
Quadruple Fluorescence Quantitative Detection Kit for Simultaneous Detection of Four Human Coronavirus Species
【技术实现步骤摘要】
同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒
本专利技术涉及一种同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，属于人冠状病毒检测
技术介绍
人冠状病毒(HumanCoronaviruses,hCoVs)感染是引起人类呼吸道疾病的重要病原之一，在常见呼吸道病原体中冠状病毒检出率约为3％-10％，是感染婴幼儿、老人及免疫功能低下的成人，从而引发咳嗽、发热、喉炎、支气管炎以及肺炎等临床症状的重要病原。目前，已知的人冠状病毒共有六种，分别是19世纪六十年代发现的人冠状病毒229E(Humancoronavirus229E,HCoV-229E)和HCoV-OC43，2003年在我国广东出现的严重急性呼吸综合征(Severeacuterespiratorysyndrome,SARS)冠状病毒SARS-CoV，2004年在荷兰分离鉴定的新型人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)，2005年在香港分离鉴定的新型人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)，以及2012年6月在中东地区出现的中东呼吸综合征(MiddleEastrespiratorysyndrome,MERS)冠状病毒MERS-CoV。流行病学研究表明，HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKUI这四种人冠状病毒在世界各地均有流行，呈全球性分布，临床症状主要表现为发热、咳嗽、鼻炎、喉炎以及支气管炎、肺炎等，给人类生命健康造成一定的负担。SARS-CoV和MERS-CoV这两种冠状病毒感染人后却能造成急性呼吸道症状，严重者引发呼吸系统和肾功能系统衰竭并造成死亡。SARS-CoV自2003年在我国广东首次出现后共造成全球约9000人感染，约800死亡，死亡率近10％。得益于全球有效的疾病防控措施，目前SARS-CoV已经消失未见流行报道。MERS-CoV作为新近出现第六种人冠状病毒，目前全球已有26个国家及地区报道了确诊病例2428例，死亡839例，死亡率高达34.6％。MERS-CoV目前主要在中东沙特阿拉伯地区流行，韩国在2015年出现过一次集中爆发流行，我国也有一例从韩国输入性病例。MERS-CoV不仅是国内疾控重点监测的传染病，同时也是目前国境口岸严防传入的重要传染病之一。早期防控是防止传染病输入播散、保障公共卫生安全、维护人类生命健康的前提条件，而开发快速、灵敏、特异的分子检测技术方法是早期防控的关键，同时也为指导临床、合理选择抗病毒药物提供重要依据。目前，针对人冠状病毒的检测技术方法主要包括病毒分离培养、血清学检测法、普通PCR法、等温扩增法、溶解曲线法以及荧光定量RT-PCR法。病毒分离培养、血清学检测法以及普通PCR法是比较常规的检测方法，这些方法在实验过程中面临检测灵敏度较低、检测时间过长、对实验室硬件要求高、对操作人员技术要求较高等诸多缺点，无法保证检测的时效性和结果的准确性。等温扩增法和荧光定量RT-PCR法是目前大多数实验室经常用到的分子检测技术方法。等温扩增法存在检测设备、检测试剂昂贵，极易发生交叉污染导致检测结果不确定性等突出问题，而且仅能实现单一病原体检测，无法实现单管多重检测等问题。溶解曲线法主要利用扩增产物Tm值的差异通过熔融曲线的位置差异来区分，这就要求引物设计必须有Tm值得差异，而单一碱基的差异就会改变Tm值，导致检测结果的不可靠性。荧光定量RT-PCR法目前同样面临仅能实现单管单重(最多两重或三重)病原体检测的问题，不仅增加了病原体筛查的次数，使得检测结果的时间大大延长，而且增加了操作过程，极大增大了检测成本，不利于疾病的快速诊断和早期防控。hCoVs快速、准确的检测不仅对监测和防控hCoVs的流行具有重要意义，也为临床早期诊断，合理选择抗病毒药物治疗等提供可靠实验室依据。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决hCoVs检测过程中耗时较长、检测效率较低、检测成本较高、检测时效性不强等缺陷，提供一种同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒；其可单管同时检测MERS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKUI四种人冠状病毒。本专利技术的技术方案，同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，所述人冠状病毒具体为MERS-CoV/HCoV-NL63/HCoV-OC43/HCoV-HKUI；所述检测试剂盒具体包括：特异性引物对和探针四组，阳性质控品和阴性质控品；所述每组异性引物对和探针均包括一对特异性引物对和一条探针序列；所述阳性质控品具体为一条人工合成的靶序列；阴性质控品为去离子水或无菌水。根据MERS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKUI四种人冠状病毒基因组序列，分别寻找各个冠状病毒的保守序列，作为优选，分别设计了适用于qRT-PCR的特异性引物组和靶探针，引物信息如下：针对人冠状病毒MERS-CoV，特异性引物对包括引物1和引物2，引物1的序列如SEQIDNo.1，引物2的序列如SEQIDNo.2；探针1序列如SEQIDNo.3；针对人冠状病毒HCoV-NL63，特异性引物对包括引物3和引物4，引物3的序列如SEQIDNo.4，引物4的序列如SEQIDNo.5；探针2序列如SEQIDNo.6；针对人冠状病毒HCoV-OC43，特异性引物对包括引物5和引物6，引物5的序列如SEQIDNo.7，引物6的序列如SEQIDNo.8；探针3序列如SEQIDNo.9；针对人冠状病毒HCoV-HKUI，特异性引物对包括引物7和引物8，引物7的序列如SEQIDNo.10，引物8的序列如SEQIDNo.11；探针4序列如SEQIDNo.12。进一步地，采用不同的荧光色对所述四条引物探针进行荧光标记。进一步地，对所述引物探针的5’端进行标记的荧光基团具体为FAM、VIC、ROX和Cy5，对3’端进行标记的淬灭基团为MGB。进一步地，组1中探针1的5'端标记FAM荧光基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团；组2中探针2的5'端标记VIC荧光基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团；组3中探针3的5'端标记ROX荧光基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团；组4中探针4的5'端标记Cy5荧光基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团。具体如下表1所示：表1进一步地，所述阳性质控品该质控品序列中包含了一段覆盖MERS-CoV特异性引物、探针的102bp的目的片段，覆盖HCoV-NL63特异性引物、探针的109bp的目的片段，覆盖HCoV-OC43特异性引物、探针的122bp的目的片段，覆盖HCoV-HKU1引物、探针的143bp的目的片段；该质控品序列由人工合成后直接用作阳性质控品，或人工合成后构建到质粒载体上，通过摇菌提取克隆质粒作为阳性质控品。进一步地，所述阳性质控品靶序列具体如SEQIDNo.13。具体为：所述四重荧光定量检测试剂盒的应用，将其应用于同时对MERS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKUI四种人冠状病毒进行检测。采用四重荧光定量检测试剂盒进行检测的方法，步骤如下：(1)样本核酸的提取：取待检测样品，对其进行核酸提取，得到样本核酸；(2)qRT-PCR检测：采用MERS-CoV/HCoV-NL63/HCoV-OC43/H本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，其特征是：所述人冠状病毒具体为MERS‑CoV/HCoV‑NL63/HCoV‑OC43/HCoV‑HKUI；所述检测试剂盒具体包括：特异性引物对和探针四组，阳性质控品和阴性质控品；所述每组异性引物对和探针均包括一对特异性引物对和一条探针序列；所述阳性质控品具体为一条人工合成的靶序列；阴性质控品为去离子水或无菌水。
【技术特征摘要】
1.同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，其特征是：所述人冠状病毒具体为MERS-CoV/HCoV-NL63/HCoV-OC43/HCoV-HKUI；所述检测试剂盒具体包括：特异性引物对和探针四组，阳性质控品和阴性质控品；所述每组异性引物对和探针均包括一对特异性引物对和一条探针序列；所述阳性质控品具体为一条人工合成的靶序列；阴性质控品为去离子水或无菌水。2.如权利要求1所述同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，其特征是：针对人冠状病毒MERS-CoV，特异性引物对包括引物1和引物2，引物1的序列如SEQIDNo.1，引物2的序列如SEQIDNo.2；探针1序列如SEQIDNo.3；针对人冠状病毒HCoV-NL63，特异性引物对包括引物3和引物4，引物3的序列如SEQIDNo.4，引物4的序列如SEQIDNo.5；探针2序列如SEQIDNo.6；针对人冠状病毒HCoV-OC43，特异性引物对包括引物5和引物6，引物5的序列如SEQIDNo.7，引物6的序列如SEQIDNo.8；探针3序列如SEQIDNo.9；针对人冠状病毒HCoV-HKUI，特异性引物对包括引物7和引物8，引物7的序列如SEQIDNo.10，引物8的序列如SEQIDNo.11；探针4序列如SEQIDNo.12。3.如权利要求1所述同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，其特征是：所述阳性质控品该质控品序列中包含了一段覆盖MERS-CoV特异性引物、探针的102bp的目的片段，覆盖HCoV-NL63特异性引物、探针的109bp的目的片段，覆盖HCoV-OC43特异性引物、探针的122bp的目的片段，覆盖HCoV-HKU1引物、探针的143bp的目的片段；该质控品序列由人工合成后直接用作阳性质控品，或人工合成后构建到质粒载体上，通过摇菌提取克隆质粒作为阳性质控品。4.如权利要求3所述同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，其特征是：所述阳性质控品靶序列具体如SEQIDNo.13。5.如权利要求2所述同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，其特征是：采用不同的荧光色对所述四条探针序列进行荧光标记。6.如权利要求5所述同时检测四种人冠状病毒的...
【专利技术属性】
技术研发人员：耿合员，朱娜，蔡丽萍，孙悦，徐聪灵，杨志俊，汪圣强，吴海磊，谭文杰，
申请(专利权)人：中华人民共和国无锡海关，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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