一种基于金银双金属纳米团簇增强荧光结合环介导等温扩增检测甲型流感病毒的方法技术

本专利公开了一种基于金银双金属纳米团簇增强荧光结合环介导等温扩增检测甲型流感病毒的方法，涉及荧光检测技术领域。金银双金属纳米团簇表现出良好的荧光性能，Cu

A Method for Detecting Influenza A Virus Based on Au-Ag Bimetallic Nanoclusters Enhanced Fluorescence and Ring-mediated Isothermal Amplification

【技术实现步骤摘要】
一种基于金银双金属纳米团簇增强荧光结合环介导等温扩增检测甲型流感病毒的方法
本专利技术涉及荧光探针检测
，更具体地说是一种以环介导等温扩增特异性识别和扩增目标核酸和双金属纳米团簇快速灵敏读出信号的方式构建的荧光检测甲型流感病毒方法。
技术介绍
流行性甲型流感病毒每年造成全世界约0.25至50万人伤亡。根据世界卫生组织（WHO）的数据，2009年，猪流感流行性流感病毒袭击了超过214个国家，大约有18,000名受害者感染病毒。特别是，禽流感（H5，H7和H9亚型）可以通过遗传重配的形式传播给人类。例如，2013年，新型禽流感H7N9病毒爆发；造成了大量的感染者死亡。虽然禽流感甲型流感病毒从人类到人类的直接传播方式尚未得到证实，但未来仍有可能出现能在人类中传播的新型禽流感。甲型H1N1流感疫情的爆发，对全球公共卫生构成严重威胁。H1N1-2009具有高度传染性。在2009年4月23日首例报告病例出现后不到一个月内，39个国家报告了8480例H1N1-2009感染病例和72例死亡病例。传统的流感诊断方法需要多个操作过程，包括病毒的裂解，病毒RNA提取和分子诊断，整个过程通常集中在实验室的内进行，需要精密的仪器和熟练的操作人员。然而这些条件在许多环境中往往难以获得，严重阻碍了流感的快速诊断。传统的PCR方法需要精密复杂仪器来控制DNA熔化，退火和引物延伸需要的不同温度，这导致其在资源受限的环境中难以应用。近年兴起的等温扩增方法，由于能在一个温度下完成核酸的循环扩增，受到了越来越多的关注。其中，环介导等温扩增方法由于卓越的特异性和高效的扩增效率，在癌症早期诊断和传染病检测等领域的应用越来越广。由于甲型H1N1流感病毒强破坏性和高死亡率，给人们的生命健康带来了严重的威胁，因此需要开发一种快速、灵敏的方法来检测甲型H1N1流感病毒。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是构建一种能特异性识别甲型H1N1流感病毒以及能实现后续信号放大的快速灵敏检测甲型H1N1流感病毒的方法。一种基于金银双金属纳米团簇增强荧光结合环介导等温扩增检测甲型流感病毒的方法，其特征是包括以下步骤：（1）双金属纳米团簇的合成将5mL牛血清蛋白（BSA,50mg/mL）与4mL氯金酸（HAuCl4,10mM）混合，在剧烈搅拌下加入1mL硝酸银（AgNO3,2.5mM），室温下继续搅拌10分钟后，加入1mL氢氧化钠（NaOH,1mM），混合液37℃反应12小时，将反应液在超纯水中透析48个小时（每6小时更换一次水），即可获得金银双金属纳米团簇（Au-AgNCs），将纳米团簇在4℃储存以供进一步使用；（2）双金属纳米团簇荧光猝灭取1mL（1）中的纳米团簇溶液，加入9mL4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲溶液（10mM，pH7.2）混合均匀，加入1mL硫酸铜（CuSO4,30μM）猝灭纳米团簇的荧光（此现象可通过测量加入硫酸铜前后纳米团簇的荧光强度来验证）；（3）环介导等温扩增反应将环介导等温扩增的6组引物在95℃下变性5分钟，取2.5μL10×等温扩增缓冲液、1.5μLMgSO4（100mM）、3.5μLdNTP（5.6mM）、1μL内引物FIP/BIP（40μM）、1μL环引物LF/LB（20μM）、1μL外引物F3/B3（5μM）、1μLBst2.0DNA聚合酶（8000U/mL）、0.8μLAMV逆转录酶（10000U/mL）、1μLH1N1病毒核酸（2.5ng）、12.5μL无RNA酶水共25μL溶液63℃反应60分钟；（4）双金属纳米团簇荧光恢复取10μL（4）中反应液，加入100μL（2）溶液中，混合均匀，室温下孵育45分钟；（5）荧光检测测量（4）中孵育完成后的溶液，荧光检测的实验参数如下：激发波长为270nm，发射波长范围为570-770nm；（6）H1N1病毒核酸检测线测定将步骤（3）中H1N1病毒核酸浓度改为一系列浓度梯度，然后在同样的参数设定下进行荧光检测，通过不同H1N1病毒核酸浓度梯度下的荧光信号扫描曲线得到工作曲线，进而实现定量分析。本专利技术的有益效果（1）利用环介导等温扩增实现目标物的特异性识别与扩增；（2）利用金银双金属纳米团簇荧光猝灭与恢复性质，实现了对环介导等温扩增结果快速灵敏的监测；（3）避免了繁琐的荧光标记步骤，简化步骤并降低了成本。附图说明图1为本文所述方法的实验原理图。具体实施方式为了更好地理解本专利技术，下面结合实施例和附图进一步阐明本专利技术的内容，但本专利技术的内容不仅仅局限于下面的实施。实施例1一种基于金银双金属纳米团簇增强荧光结合环介导等温扩增检测甲型流感病毒的方法，其特征是包括以下步骤：（1）双金属纳米团簇的合成将5mL牛血清蛋白（BSA,50mg/mL）与4mL氯金酸（HAuCl4,10mM）混合，在剧烈搅拌下加入1mL硝酸银（AgNO3,2.5mM），室温下继续搅拌10分钟后，加入1mL氢氧化钠（NaOH,1mM），混合液37℃反应12小时，将反应液在超纯水中透析48个小时（每6小时更换一次水），即可获得金银双金属纳米团簇（Au-AgNCs），将纳米团簇在4℃储存供进一步使用；（2）双金属纳米团簇荧光猝灭取1mL（1）中的纳米团簇溶液，加入9mL4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲溶液（10mM，pH7.2）混合均匀，加入1mL硫酸铜（CuSO4,30μM）猝灭纳米团簇的荧光（此现象可通过测量加入硫酸铜前后的荧光强度来验证）；（3）环介导等温扩增反应将环介导等温扩增的6组引物在95℃下变性5分钟，取10×等温扩增缓冲液、6mMMgSO4、1.4mMdNTP、1.6μM内引物（FIP,BIP）、0.8μM环引物（LF,LB）、0.4μM外引物（F3,B3）、0.8UBst2.0DNA聚合酶、0.8μLAMV逆转录酶（10000U/mL）、2.5ngH1N1病毒核酸共25μL溶液65℃反应60分钟；（4）双金属纳米团簇荧光恢复取10μL（4）中反应液，加入100μL（2）溶液中，混合均匀，室温下孵育45分钟；（5）荧光检测测量（5）中孵育完成后的溶液，荧光检测的实验参数如下：激发波长为270nm，发射波长范围为570-770nm；（6）H1N1病毒核酸检测线测定将步骤（3）中H1N1病毒核酸浓度改为一系列浓度梯度，然后在同样的参数设定下进行荧光检测，通过不同H1N1病毒核酸浓度梯度下的荧光信号扫描曲线得到工作曲线，进而实现定量分析。序列表<110>济南大学<120>一种基于金银双金属纳米团簇增强荧光结合环介导等温扩增检测甲型流感病毒的方法<130>2019<160>6<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>40<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>1ggcacggtgagcgtgaacacaccaatcctgtcacctctga40<210>2<211>40<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSeq本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于金银双金属纳米团簇增强荧光结合环介导等温扩增检测甲型流感病毒的方法，其特征是包括以下步骤：（1）双金属纳米团簇的合成将5 mL 牛血清蛋白（BSA, 50 mg / mL）与4 mL 氯金酸（HAuCl4, 10 mM）混合，在剧烈搅拌下加入1 mL 硝酸银（AgNO3, 2.5 mM），室温下继续搅拌10分钟后，加入1mL 氢氧化钠（NaOH, 1 mM），混合液37 ℃反应12小时，将反应液在超纯水中透析48个小时（每6小时更换一次水），即可获得金银双金属纳米团簇（Au‑Ag NCs），将纳米团簇在4 ℃储存供进一步使用；（2）双金属纳米团簇荧光猝灭取1 mL（1）中的纳米团簇溶液，加入9 mL 4‑（2‑羟乙基）‑1‑哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲溶液（10 mM，pH7.2）混合均匀，加入1 mL 硫酸铜（CuSO4, 30 μM）猝灭纳米团簇的荧光（此现象可通过测量加入硫酸铜前后的荧光强度来验证）；（3）环介导等温扩增反应将环介导等温扩增的6组引物在95 ℃下变性5分钟，其中内引物FIP序列为GGCACGGTGAGCGTGAACACACCAATCCTGTCACCTCTGA，内引物BIP序列为GAGCGAGGACTGCAGCGTAGGTTTGGATCCCCATTCCCAT，环引物LF序列为AAATCCTAAAATCCCC，环引物LB序列为CGCTTTGTCCAAAATGCC，外引物F3序列为GCGCTCATGGAATGGCTAA，外引物B3序列为TGACCGCTCTGTCCATGTT；取2.5μL 10 × 等温扩增缓冲液、1.5μL MgSO4（100 mM）、3.5μL dNTP（5.6 mM）、1 μL内引物FIP / BIP（40 μM）、1 μL环引物LF / LB（20 μM）、1 μL外引物F3 / B3（5 μM）、1 μL Bst 2.0 DNA聚合酶（8000 U / mL）、0.8 μL AMV 逆转录酶（10000U / mL）、1 μL H1N1病毒核酸（2.5 ng）、12.5 μL无RNA酶水共25 μL溶液63 ℃反应60分钟；（4）双金属纳米团簇荧光恢复取10 μL （4）中反应液，加入100 μL （2）溶液中，混合均匀，室温下孵育45分钟；（5）荧光检测测量（4）中孵育完成后的溶液，荧光检测的实验参数如下：激发波长为270 nm，发射波长范围为570 ‑ 770 nm；（6）H1N1病毒核酸检测线测定将步骤（3）中H1N1病毒核酸浓度改为一系列浓度梯度，然后在同样的参数设定下进行荧光检测，通过不同H1N1病毒核酸浓度梯度下的荧光信号扫描曲线得到工作曲线，进而实现定量分析。...

【技术特征摘要】
1.一种基于金银双金属纳米团簇增强荧光结合环介导等温扩增检测甲型流感病毒的方法，其特征是包括以下步骤：（1）双金属纳米团簇的合成将5mL牛血清蛋白（BSA,50mg/mL）与4mL氯金酸（HAuCl4,10mM）混合，在剧烈搅拌下加入1mL硝酸银（AgNO3,2.5mM），室温下继续搅拌10分钟后，加入1mL氢氧化钠（NaOH,1mM），混合液37℃反应12小时，将反应液在超纯水中透析48个小时（每6小时更换一次水），即可获得金银双金属纳米团簇（Au-AgNCs），将纳米团簇在4℃储存供进一步使用；（2）双金属纳米团簇荧光猝灭取1mL（1）中的纳米团簇溶液，加入9mL4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲溶液（10mM，pH7.2）混合均匀，加入1mL硫酸铜（CuSO4,30μM）猝灭纳米团簇的荧光（此现象可通过测量加入硫酸铜前后的荧光强度来验证）；（3）环介导等温扩增反应将环介导等温扩增的6组引物在95℃下变性5分钟，其中内引物FIP序列为GGCACGGTGAGCGTGAACACACCAATCCTGTCACCTCTGA，内引物BIP序列为GAGCGAGGACTGCAGCGTAGGTTTGGATCCCCATTCCCAT，环引物L...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘海云，何涛，高奕，于京华，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37