用于小报春不同组织基因表达分析的内参基因及其引物制造技术

本发明专利技术公开了用于小报春不同组织荧光定量PCR的内参基因，其为GAPDH和STPP，所述的GAPDH的序列如Seq ID No.1所示，所述的STPP的序列如Seq ID No.9所示。本发明专利技术以小报春不同花期花器官和不同组织为试验材料，基于前期的转录组测序数据，从中选取10个内参基因进行试验，并分别利用geNorm、NormFinder和Bestkeeper软件对所得结果进行分析评估。不同组织条件下，GAPDH和STPP组合使用作内参可以得到更可靠的结果。

Internal Reference Genes and Their Primers for Gene Expression Analysis in Different Tissues of Primula tabulaeformis

【技术实现步骤摘要】
用于小报春不同组织基因表达分析的内参基因及其引物
本专利技术属于植物分子生物学领域，具体涉及用于小报春不同组织基因表达分析的内参基因及其引物。
技术介绍
实时荧光定量PCR(Quantativereal-timePCR,qRT-PCR)是在PCR扩增过程中，添加荧光物质以便对PCR进程进行实时检测。其定量的依据是在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，该技术克服了常规PCR的缺点，并且由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点迅速发展，现在已经应用到生命科学研究的各个领域。利用qRT-PCR技术可以进行基因表达分析，然而，在分析过程中，RNA的质量和产量、反转录效率的差异以及其他阻碍因素等都会对目的基因表达结果的准确性产生影响。因此需要选择合适的内参基因进行校正和标准化，从而减小检测样本之间的差异。理想的内参基因应该在所有的细胞中和生理状态下都能较稳定地表达，可以完全用于不同类型的样品，但是在实际过程中，随着试验条件的变化，没有任何一种内参基因的表达是始终稳定的，即在一种实验条件下合适的内参基因并不一定适用于另一种实验条件，或者不同物种间的内参基因也可能是不同的。未经验证地使用一种基因作为内参，轻则可能难以发现基因表达的细小差别，重则可能出现完全相反的结果。使用不稳定表达的内参基因可能对靶基因表达量分析有极大影响，因此在具体实验条件下选择表达稳定的内参基因至关重要。研究者通常使用看家基因作为内参，因为这些基因广泛参与有机体的基本生化反应，这使得其在某些器官组织中可以稳定地表达。目前，常用的传统内参有肌动蛋白基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因、组蛋白基因、微管蛋白基因、泛素结合酶基因和延伸因子等。迄今为止，关于报春花属植物内参基因筛选的领域依旧是一片空白。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种用于小报春组织基因表达分析中稳定性更高的内参基因。本专利技术提供的用于小报春不同花期荧光定量PCR的内参基因，其为GAPDH和STPP，所述的GAPDH的序列如SeqIDNo.1所示，所述的STPP的序列如SeqIDNo.9所示。本专利技术还提供用于小报春不同组织基因表达分析的试剂，其包括：1)检测所述的GAPDH表达水平的物质；和2)检测所述的STPP表达水平的物质。在本专利技术一个优选的实施方案中，所述检测所述的GAPDH表达水平的物质为扩增所述基因或其片段的引物；所述检测所述的STPP表达水平的物质为扩增所述基因或其片段的引物。在本专利技术一个更为优选的实施方案中，所述的检测所述的GAPDH表达水平的物质为序列如SeqIDNo.17所示的单链DNA和序列如SeqIDNo.18所示的单链DNA；所述的检测所述的STPP表达水平的物质为序列如SeqIDNo.25所示的单链DNA和序列如SeqIDNo.26所示的单链DNA。本专利技术还提供含有所述试剂的用于小报春不同组织基因表达分析的试剂盒。在本专利技术的一个实施方案中，所述试剂盒还可含有分析基因表达所需的其他成分，如PCR所需要的其它试剂。在本专利技术的一个实施方案中，所述试剂盒还可含有用于检测不同组织表达的目标基因表达水平的物质，如目标PCR所需要的引物，优选还含有PCR所需要的其他试剂。本申请中，术语“组织”可指植物器官或其部分，也可以指植物的组织或其部分。所述的小报春不同组织可为根、茎、叶、花等器官或组织或它们的一部分。本专利技术还提供所述试剂在小报春不同组织基因表达分析中的应用。本专利技术以小报春不同花期的花器官和不同组织为试验材料，基于前期的转录组测序数据，从中选取10个内参基因进行试验，并分别利用geNorm、NormFinder和Bestkeeper软件对所得结果进行分析评估。不同组织条件下，GAPDH、CSD和STPP是最稳定的基因。相比于单基因内参，GAPDH和STPP组合使用作内参可以得到更可靠的结果。附图说明图1所示为候选内参基因引物扩增片段。图2所示为10个候选内参基因的熔解曲线图。图3所示为所有样品中qRT-PCRCt值。盒中的线表示中位数，盒子上端和下端分别表示25％和75％，上下边缘线分别表示最大和最小值。图4所示为geNorm软件分析结果(上：所有样品；下：不同组织)。图5所示为geNorm最佳内参基因数目分析。图6所示为Venn图分析最佳内参基因。图7所示为不同内参基因组合对PfLIS/NES在不同组织表达量的影响。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1试验所用小报春采集于2016年2月至4月。取不同开花时期的花朵。不同花期包括4个阶段：花蕾期、初花期、盛花期和末花期。各阶段的描述标准如下：花蕾期：花朵处于未开放状态，花萼紧紧包裹花瓣；初花期：花朵处于半开放状态，花萼外展，花瓣伸长；盛花期：花朵处于完全盛开状态，花萼和花瓣完全展开；末花期：花朵处于开放状态，花萼和花瓣出现萎蔫并向后翻展。不同组织包括：根、花茎、叶和花(盛花期)。根在采集后用清水仔细洗尽泥土并用滤纸吸干水分。所有的样品在采集后立即用液氮冷冻并保存于-80℃环境中。从转录组测序数据库中选出与拟南芥同源性较高的10个基因序列作为候选内参基因(表1)，包括6个传统内参基因(28S,ACT,TUA,TUB,HIS,GAPDH)和4个新型内参基因(RPL18a,STPP,CSD,RNApolII)。利用PrimerPremier5.0进行引物设计。表1候选内参基因信息注：BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)通过熔解曲线分析和普通PCR对设计的10对qRT-PCR引物特异性进行验证。普通PCR反应体系如下：反应条件为：95℃3min；95℃30s，48-58℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。反应完成后通过1％琼脂糖凝胶电泳检测各PCR产物。结果如图1所示。从图1可以看出，各候选内参基因普通PCR均有与预期大小相符的PCR产物，条带明显、单一，无非特异性扩增，说明引物特异性良好，可用于后续试验。以cDNA为模板，用ddH2O依次稀释5个梯度，每个梯度稀释10倍，即每个模板的浓度分别为1、10-1、10-2、10-3、10-4。每个反应设置3个重复。利用AnalytikJenaqTOWER2.2荧光定量仪(AG，德国)进行qRT-PCR试验，反应体系如下，反应条件：95℃3min；95℃5s，80℃30s，44个循环；60-95℃熔解曲线分析。试验设置了3个技术重复，并通过仪器自动读取相关数据。候选内参基因引物及相关信息如表2所示。qRT-PCR反应体系：结果见表2和图2。可知各候选内参基因标准曲线相关系数r2>0.988，扩增效率均在90％-110％之间，熔解曲线均只产生单一熔解峰，无非特异性扩增干扰。上述试验结果说明各候选内参基因的线性分析和扩增效率均符合要求。表2候选内参基因引物及相关信息在小报春7个样品中，10个候选内参基因的Ct值在17-26之间。Ct值越大，基因表达量越低；反之亦然。由图3可知，ACT的Ct值最小(17.63)而CSD的Ct值最大(26.58)，说明ACT高丰度表达，而CSD低丰度表达。此外，各候选内参基因在不同样品中的表达变化差异本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于小报春不同组织荧光定量PCR的内参基因，其为GAPDH和STPP，所述的GAPDH的序列如Seq ID No.1所示，所述的STPP的序列如Seq ID No.9所示。

【技术特征摘要】
1.用于小报春不同组织荧光定量PCR的内参基因，其为GAPDH和STPP，所述的GAPDH的序列如SeqIDNo.1所示，所述的STPP的序列如SeqIDNo.9所示。2.用于小报春不同组织基因表达分析的试剂，其特征在于，包括：1)检测权利要求1所述的GAPDH表达水平的物质；和2)检测权利要求1所述的STPP表达水平的物质。3.如权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述检测权利要求1所述的GAPDH表达水平的物质为扩增所述基因或其片段的引物；所述检测权利要求1所述的STPP表达水平的物质为...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾茵，黄远祥，李西，周鹏，刘思岑，江明艳，
申请(专利权)人：四川天艺优境环境科技有限公司，四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51