一种柑橘遗传背景鉴定用PCR引物、试剂盒及鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一种柑橘遗传背景鉴定用PCR引物，引物的核酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，另外本发明专利技术还提供了一种包含上述柑橘遗传背景鉴定用PCR引物的试剂盒及柑橘遗传背景的鉴定方法。本发明专利技术提供的柑橘遗传背景鉴定用PCR引物特异性高，扩增效率好，仅需一对引物即可快速鉴定柑橘的遗传背景，成本低，省时省力。

A PCR Primer, Kit and Identification Method for Citrus Genetic Background Identification

【技术实现步骤摘要】
一种柑橘遗传背景鉴定用PCR引物、试剂盒及鉴定方法
本专利技术涉及分子生物
，具体涉及一种柑橘遗传背景鉴定用PCR引物、试剂盒及鉴定方法。
技术介绍
柑橘类水果是世界上产量最大的水果。柑橘可跨种属杂交，种属间杂种多，遗传背景复杂，目前还有很多未知的柑橘变种亟待鉴定。采用简便的技术方法弄清柑橘的遗传背景，可以为砧木资源的挖掘提供思路，加快人工杂交品种的选育进程。尽管柑橘可根据枝叶形态等鉴别其属种，但是柑橘的形态学标记较少，种间差异不明显。随着分子生物学的发展，DNA分子标记鉴定因快速准确、不受环境影响等优点逐渐发挥重要作用。在柑橘的研究中，越来越多的分子标记被开发，但是多数鉴定需要几对甚至十几对引物才能确定，而利用一对引物鉴别柑橘遗传背景的方法鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术为解决上述问题提供一种柑橘遗传背景鉴定用PCR引物、试剂盒及鉴定方法。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种柑橘遗传背景鉴定用PCR引物，包括上游引物Citrus-F和下游引物Citrus-R，其序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。其中SEQIDNO:1的序列为TGCTCTAGTATGCCAATCTGTGTCA。SEQIDNO:2的序列为TGATCACTGAGCAGTTTATGGGG。本专利技术还提供了一种柑橘遗传背景鉴定用试剂盒，包括上述柑橘遗传背景鉴定用PCR引物。进一步，所述试剂盒还包括TaqDNA聚合酶、buffer缓冲液和dNTP。本专利技术还提供了一种柑橘遗传背景鉴定方法，使用上述试剂盒，方法为，提取柑橘待测样品的DNA，用所述柑橘遗传背景鉴定用PCR引物进行PCR扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。当扩增产物中出现一条扩增条带时，若条带大小为1.8K判定为具有柚的遗传背景；若条带大小为1.4K判定为具有橘的遗传背景；若条带大小为1K判定为具有原始柑橘的遗传类型；当扩增产物中出现两条扩增条带时，根据孟德尔遗传规律进行判定。进一步，所述原始柑橘包括枳、莽山野柑、枸橼、宜昌橙。进一步，所述待测样品为待测柑橘的叶片。进一步，PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，56℃复性15秒，72℃延伸2分钟，共35个循环，最后72℃延伸5分钟。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的柑橘遗传背景鉴定用PCR引物特异性高，扩增效率好，仅需一对引物即可快速鉴定柑橘的遗传背景，成本低，省时省力。本专利技术能对未知柑橘和已知柑橘品种进行鉴定，对柑橘资源的挖掘和保护有重要意义。附图说明图1为本专利技术实施例1不同柑橘种PCR扩增凝胶电泳结果图；图2为本专利技术实施例2中A、B、C、D的PCR扩增凝胶电泳结果图；具体实施方式以下结合附图及具体实施例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。本专利技术的供试材料采自华中农业大学脱毒楼、丹江口砧木繁育基地和陕西城固县斗山柑橘专业合作社。实施例1选取不同的柑橘种，香橙、枳、陕西红桔、摩洛哥酸橙、泸酸橙、枸橼、桠柑、莽山野柑、山金柑、红心柚、沙田柚、高班柚、枳雀、老酸橙、温州蜜柑、宜昌橙、纽荷尔脐橙、暗柳橙、伏令夏橙、城固酸橙、城固冰糖橙、南丰蜜桔、克里曼丁和本地早，取不同柑橘种的叶片，采用CTAB法提取DNA组，用上游引物Citrus-F(SEQIDNO:1TGCTCTAGTATGCCAATCTGTGTCA)和下游引物Citrus-R(SEQIDNO:2TGATCACTGAGCAGTTTATGGGG)分别对提取的不同柑橘种的DNA进行PCR扩增，PCR反应体系为：ddH2O18ul，2×PhantaMaxBuffer25ul，Citrus-F2ul，Citrus-R2ul，dNTPMix(10mMeach)1ul，待检测DNA1ul，PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase1ul。PCR反应程序为：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，56℃复性15秒，72℃延伸2分钟，共35个循环，最后72℃延伸5分钟。PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示，不同泳道的条带具有多态性，根据条带大小可分为1.8K，1.4K，1K三种类型。根据报道，现代栽培柑橘的三个祖先分别是橘、柚和香橼，对应的条带大小分别为1.4K，1.8K，1K。橘和柚杂交形成酸橙或其他杂柑，城固酸橙、老酸橙、泸酸橙、摩洛哥酸橙的条带为1.8K和1.4K，本地早、克里曼丁橘、椪柑等也是1.8K和1.4K的类型；南丰蜜桔、温州蜜柑、陕西红桔为1.4K的橘类型，已知南丰蜜桔为我国特有的纯种宽皮橘；高班柚、沙田柚、红心柚为1.8K的柚类型；值得说明的是甜橙类，甜橙是酸橙在进化的过程中受到柚基因组的渗入而产生的，因此伏令夏橙、暗柳橙和纽荷尔脐橙等甜橙类为1.8K的纯合类型。在橘、柚和香橼之前的柑橘类型，划入原始类型，目前报道的宜昌橙和莽山野柑，这些原始类型的柑橘，条带均为纯合的1K，因此认为含有1k的序列具有原始柑橘的遗传背景。柑橘复杂的遗传背景不限于此，枳属的枳为柑橘生产上最常用的砧木，同样为1K类型。枳的叶片为三出复叶，据此特征可判断柑橘是否有枳的背景。根据电泳结果，再结合生产实际，使用我们的引物鉴定的柑橘遗传背景与文献报道的结论一致。。实施例2分别取A、B、C、D四种柑橘，A和B是陕西城固保存的枳资源，C为资阳香橙、D为衢州香橙，取叶片，采用CTAB法提取DNA组，并用上游引物Citrus-F和下游引物Citrus-R进行PCR扩增，PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图2所示，A、C、D泳道均为两条带(1.4K,1K)，已知香橙是橘(1.4K)和宜昌橙(1K)的杂交种，说明A可能具有橘的遗传背景，为枳和橘的杂交种。以上所述仅为本专利技术的较佳实施例，并不用以限制本专利技术，凡在本专利技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。序列表<110>华中农业大学<120>一种柑橘遗传背景鉴定用PCR引物、试剂盒及鉴定方法<160>2<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>1tgctctagtatgccaatctgtgtca25<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>2tgatcactgagcagtttatgggg23本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种柑橘遗传背景鉴定用PCR引物，其特征在于，包括上游引物Citrus‑F，其序列为SEQ ID NO:1；下游引物Citrus‑R，其序列为SEQ ID NO:2。

【技术特征摘要】
1.一种柑橘遗传背景鉴定用PCR引物，其特征在于，包括上游引物Citrus-F，其序列为SEQIDNO:1；下游引物Citrus-R，其序列为SEQIDNO:2。2.一种柑橘遗传背景鉴定用试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述柑橘遗传背景鉴定用PCR引物。3.根据权利要求2所述的一种柑橘遗传背景鉴定用试剂盒，其特征在于，还包括TaqDNA聚合酶、buffer缓冲液和dNTP。4.一种柑橘遗传背景鉴定方法，其特征在于，使用权利要求2或3任一项所述的柑橘遗传背景鉴定用试剂盒，该方法为：提取柑橘待测样品的DNA，用所述柑橘遗传背景鉴定用PCR引物进行PCR扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，当扩增...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘志勇，樊正炎，彭抒昂，邓秀新，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42