检测烟草eIF4E-1基因单碱基插入突变的Bi-PASA标记引物及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测烟草eIF4E‑1基因单碱基插入突变的Bi‑PASA标记引物及方法，所述引物序列如下：外引物P的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，外引物Q的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，内引物A的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，内引物B的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，上述引物序列中带下划线的碱基为引入的错配碱基，小写字母碱基为非互补富含G+C序列。采用本发明专利技术的四个引物，结合一次PCR和电泳，便可以准确地检测出eIF4E‑1单碱基插入突变等位基因回交转育过程中回交和自交后代的基因型，提高分子标记辅助轮回选择效率，加快育种进程。

Bi-PASA Marker Primers and Methods for Detecting Single Base Insertion Mutation of Tobacco eIF4E-1 Gene

【技术实现步骤摘要】
检测烟草eIF4E-1基因单碱基插入突变的Bi-PASA标记引物及方法
本专利技术属于植物生物
，具体涉及一种检测烟草eIF4E-1基因单碱基插入突变的Bi-PASA标记引物，本专利技术还涉及一种检测烟草eIF4E-1基因单碱基插入突变的方法。
技术介绍
烟草是重要的经济作物之一，烟草马铃薯Y病毒病，又称为脉斑病，是由马铃薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)引起的一种烟草系统性侵染病害，常年造成烟叶产量和质量损失。选育和种植抗病品种是防治该病最经济有效的方法。研究显示，烟草PVY的抗源分为两大类，一类是以VAM(TI1406)及其衍生种质TN86为代表的隐性基因位点(VAM和va)控制的抗性，另一类是以非洲烟草(Nicotianaafricana)为代表的对PVY免疫的抗性。目前，受va位点控制的抗源被广泛应用于烟草抗病育种。为了提高va位点的育种利用效率，国内外研究者相继开发了与va位点相关的分子标记，如RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA(RAPD)和SequenceCharacterizedAmplifiedRegion(SCAR)标记。这些标记与va位点间的遗传距离较远，导致利用标记数据判断抗性表型误差较大，进而限制了这类分子标记在育种中的实际应用。在抗性获得的研究中，Noguchis等认为va基因型烟草植株的抗性是由于对PVY感病的基因片段的缺失造成的。2014年，Julio等采用新一代测序技术比较烟草抗感PVY近等基因系转录组，明确了烟草eIF4E-1基因为烟草PVY隐性抗病基因，即感PVY基因，该基因属于真核细胞翻译起始因子(eukaryoticinitiationfactor，简称为eIF)的一种类型。2015年，刘勇等根据烟草eIF4E-1基因及其家族基因的序列信息，开发出一个与eIF4E-1野生型等位基因紧密连锁的显性标记，由于该标记不能作为eIF4E-1等位基因缺失的共显性标记，限制了其在实际育种的应用。2018年，Dluge等利用RNA测序的方法比较了TI1406、K326-va和K326三种烟草中的基因表达差异，发现在具有PVY抗性的TI1406和K326-va中，真核翻译起始因子eIF4E-1基因所在的染色体区段发生大范围的缺失，由于建立eIF4E-1等位基因缺失的共显性标记需要了解该基因缺失连接片段的序列特点，而eIF4E-1基因及其侧翼序列的大范围缺失，造成研究者未能有效地克隆到该基因的缺失连接片段、获得序列信息，从而未能开发出等位基因缺失的共显性标记。此前，本单位通过对烟草品种开阳小黑烟中的eIF4E-1等位基因进行测序和序列比对鉴定到1个基因内特异性单碱基插入位点，随后针对该突变位点开发出共显性分子标记并已向国家专利局提出名为“烟草eIF4E-1突变位点特异性共显性分子标记及其应用”的专利技术专利申请，申请号为“201810989309.6”，该专利技术公开了一种烟草eIF4E-1单碱基插入突变位点特异性共显性分子标记，标记检测由2个单一PCR扩增反应组成。与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-W，扩增引物对为FW/RWm，扩增片段大小543bp；与突变型位点检测相关的标记命名为ASM-m，扩增引物对为Fm/RWm，扩增片段片段大小543bp。利用该标记和引物可以对PVY抗性供体亲本的回交转育后代单株的基因型进行准确选择，但每个单株基因型的检测都需要进行2个单一PCR扩增，操作步骤较为复杂。双向等位基因特异PCR(bi-directionalPCRamplificationofspecificalleles,Bi-PASA)能够在一个PCR反应体系里同时检测两个不同长度的等位基因片段，是一种更为简捷的等位基因分型方法，其通过1次PCR反应即可检测已知突变位点的类型。最近几年，利用双向等位基因特异PCR在人类疾病、花生和大麦等生物检测上已经收到越来越多的研究者重视。但双向等位基因特异PCR要求在同一反应体系中同时对不同的基因类型进行特异性扩增，因而影响其扩增效果的因素较多，不同引物之间是否形成二聚体、退火温度差、引物的配比、反应温度等不同参数均具有较高的要求，因此，将检测不同基因类型的特异性引物混合，利用双向等位基因特异PCR在同一反应体系中进行检测，未必能够获得理想效果，只能退而求其次，利用不同基因类型的特异性引物单独检测各自对应的基因类型。本试验在开阳小黑烟中检测到突变型eIF4E-1等位基因的基础上，探索通过双向等位基因特异PCR在同一反应中完成两个eIF4E-1等位基因分子标记的扩增，为烟草抗性育种分子标记相关研究提供一种更加省时、省力、经济有效的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测烟草eIF4E-1基因单碱基插入突变的Bi-PASA标记引物。本专利技术的另一目的是提供一种检测烟草eIF4E-1基因单碱基插入突变的检测试剂盒。本专利技术的再一目的是提供一种检测烟草eIF4E-1基因单碱基插入突变的方法，该方法基于Bi-PASA的四个引物的核苷酸序列，以及该引物在检测携带突变型eIF4E-1等位基因的抗PVY烟草(rr型)、携带野生型eIF4E-1等位基因的感PVY烟草(RR型)及同时含有突变型和野生型eIF4E-1等位基因的杂合型烟草(Rr型)的用法本专利技术的技术方案是：第一方面，本专利技术提供一种检测烟草eIF4E-1基因单碱基插入突变的Bi-PASA标记引物，其特征在于，所述引物序列如下：外引物P的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，具体为：5’-CAAGTACCCTTTTCCTACTAAAATCTATAACTAAG-3’；外引物Q的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，具体为：5’-gccggACAGAATTAGTGTCACATAAAATTGAAGATTTTAC-3’；内引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，具体为：5’-cggCACTTTTTCCACTGTCGAAGATTTTAG-3’；内引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，具体为：5’-GAATATGAAATAACTTACCCCCAAAAACT-3’；上述引物序列中带下划线的碱基为引入的错配碱基，小写字母碱基为非互补富含G+C序列。第二方面，本专利技术提供一种含有所述标记引物的检测试剂盒。包括以下步骤：步骤1、提取烟草品种基因组DNA；步骤2、利用所述的引物或检测试剂盒扩增烟草品种基因组DNA，获得PCR扩增产物；步骤3、将PCR扩增产物进行电泳，对基因型进行判定。可选地，步骤3中将PCR扩增产物进行电泳，对基因型进行判定具体按照以下步骤实施：将扩增产物于琼脂糖凝胶电泳分离，100V恒定电泳50min检测，如果扩增产物为713bp和440bp两种片段，显示标记个体基因型为RR型，为纯合野生型个体，电泳条带为两条带；如果扩增产物为714bp和325bp两种片段，显示标记个体基因型为rr型，为纯合突变型个体，电泳条带为两条带；如果扩增产物为713/714bp，440bp和325bp三条带，显示标记个体基因型为Rr型，为杂合突变型个体，电泳条带为三条带。可选地，步骤1中烟草品种基因组DNA为采用AxyPrep基因组DNA小量制备试剂盒提取烟草品种基因组DNA得到。可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测烟草eIF4E‑1基因单碱基插入突变的Bi‑PASA标记引物，其特征在于，所述引物序列如下：外引物P的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：5’‑CAAGTACCCTTTTCCTACTAAAATCTATAACTAAG‑3’；外引物Q的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为：5’‑gccggACAGAATTAGTGTCACATAAAATTGAAGATTTTAC‑3’；内引物A的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体为：5’‑cggCACTTTTTCCACTGTCGAAGATTTTAG‑3’；内引物B的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体为：5’‑GAATATGAAATAACTTACCCCCAAAAACT‑3’；上述引物序列中带下划线的碱基为引入的错配碱基，小写字母碱基为非互补富含G+C序列。

【技术特征摘要】
1.一种检测烟草eIF4E-1基因单碱基插入突变的Bi-PASA标记引物，其特征在于，所述引物序列如下：外引物P的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，具体为：5’-CAAGTACCCTTTTCCTACTAAAATCTATAACTAAG-3’；外引物Q的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，具体为：5’-gccggACAGAATTAGTGTCACATAAAATTGAAGATTTTAC-3’；内引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，具体为：5’-cggCACTTTTTCCACTGTCGAAGATTTTAG-3’；内引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，具体为：5’-GAATATGAAATAACTTACCCCCAAAAACT-3’；上述引物序列中带下划线的碱基为引入的错配碱基，小写字母碱基为非互补富含G+C序列。2.含有权利要求1所述标记引物的检测试剂盒。3.一种检测烟草eIF4E-1基因单碱基插入突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、提取烟草品种基因组DNA；步骤2、利用权利要求1所述的引物或权利要求2所述的检测试剂盒扩增烟草品种基因组DNA，获得PCR扩增产物；步骤3、将PCR扩增产物进行电泳，对基因型进行判定。...

【专利技术属性】
技术研发人员：林世锋，王仁刚，任学良，余婧，龙明锦，张洁，余世洲，张吉顺，王自力，曾吉凡，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：贵州,52