本发明专利技术提供了检测水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的引物组、试剂盒及其检测方法和应用，涉及水稻育种技术领域。本发明专利技术所述引物组包括：正向引物、反向引物和通用引物。利用本发明专利技术所述引物组可筛选出检测水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的特异SNP位点，显著提高氮高效种质资源的鉴定准确性和检测效率；且检测方法准确可靠，操作简便，减少了氮素利用率测定的规模和频率，降低研发成本，缩短育种进程，提高育种效率。在分子辅助育种领域，为氮高效种质资源的创制和水稻氮高效新品种的培育提供了技术支撑。
Primers, kits and detection methods for nitrate transporter gene in Rice
【技术实现步骤摘要】
检测水稻硝酸盐转运蛋白基因的引物组、试剂盒及其检测方法和应用
本专利技术属于水稻育种
，具体涉及检测水稻硝酸盐转运蛋白基因的引物组、试剂盒及其检测方法和应用。
技术介绍
水稻是我国最重要的粮食作物，在我国粮食生产和国民经济建设中占有十分重要的地位。长期以来，我国一直重视提高水稻单位面积的产量，并取得了举世瞩目的成就。自1995年起，我国水稻单产稳定在6t/ha以上，跨入了世界先进行列。但进入1990年以后，水稻单产的增长速度滞缓。为了进一步提高产量潜力，我国于1996年启动了以理想株型与亚种间杂种优势相结合为技术路线的超级杂交稻育种计划，目前已育成80余个超级稻品种。这些品种产量高，兼顾品质与抗性，在试验示范区或特定气候条件下产量可达到12～21t/ha，展示了超级稻的巨大增产潜力，这为稳定和保证我国的水稻生产起到了十分重要的作用。水肥(尤其是氮肥)投入量大，水肥资源利用效率低是我国目前水稻生产中的一个突出问题。据统计，我国目前水稻平均氮肥施用量为180kg/ha，高出世界水稻氮肥平均施用量的75％。在江苏省的部分县(市)，水稻氮肥平均施用量超过300kg/ha，少数田块甚至高达350kg/ha。氮肥的过量施用造成了氮素利用率大幅度下降。我国水稻氮肥吸收利用率(RE，施肥区作物氮素积累量与氮空白区作物氮素积累量的差占施氮总量的百分数)仅为30～35％，比发达国家低15～20个百分点。在江苏、浙江等高氮投入区，RE甚至不到20％。在较好的营养及作物管理条件下，水稻氮肥的农学利用率(AE，施用单位氮素所能增加的稻谷产量)可以达到20kg稻谷/kgN以上。但在我国，水稻的AE已由1958～1963年的15～20kg稻谷/kgN下降到1981～1983年的9.1kg稻谷/kgN。近年来，随着氮肥投入量的增大，AE仍在进一步下降。氮肥的过量施用还会造成水稻倒伏、病虫害发生严重和稻米品质变劣，同时也会造成严重的环境污染。水稻氮素利用效率的研究不仅具有重大的理论价值，也是生产实践中面临的重大科学问题。NRT1.1B是水稻肽转运蛋白家族成员，对水稻硝酸盐的吸收和转运起着重要作用。该基因在籼粳稻间一个碱基的变异(A/G)，导致相应氨基酸的改变(籼稻为甲硫氨酸，粳稻为苏氨酸)，从而导致籼粳稻硝酸盐吸收利用的差异。Hu等(2015)通过图位克隆方法从籼稻IR24中克隆了硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B，利用标记辅助选择技术将籼型NRT1.1B基因导入到粳稻，可提高粳稻的氮肥利用率，并获得较高的产量，在改良粳稻的氮肥利用率和提高产量方面具有重大的利用价值，但是目前并没有一种高效准确检测NRT1.1B基因的KASP标记。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种检测水稻硝酸盐转运蛋白基因的引物组、试剂盒及其检测方法和应用，利用所述引物组、试剂盒及其检测方法能够准确地鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因型，显著提高氮高效种质资源的鉴定准确性和检测效率，操作简便，减少了氮素利用率测定的规模和频率，降低了研发成本，缩短了育种进程，提高了育种效率。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了检测水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的引物组，所述引物组包括：核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的正向引物、核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的反向引物和核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的通用引物。本专利技术还提供了一种鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的试剂盒，所述试剂盒中包含权利要求1所述引物组，还包括：2×KASPMasterMix。本专利技术还提供了一种硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的KASP标记检测方法，包括以下步骤:(1)提取待测样品和对照样品的全基因组DNA，以所述全基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物组或权利要求2所述试剂盒进行KASP反应，得KASP反应产物；(2)对所述KASP反应产物进行扫描，根据荧光颜色判断待测样品的基因型，若待测样品产物荧光显示颜色与阳性对照相同，则待测水稻品种携带籼型NRT1.1B基因；若待测样品产物荧光显示颜色与阴性对照相同，则待测水稻品种含有粳型nrt1.1b基因；若待测样品产物荧光显示颜色为绿色，则待测样品基因型为杂合型NRT1.1B/nrt1.1b。优选的，步骤(1)所述KASP反应的体系以5.07μL计为：2.5μL模板DNA，2×KASPMasterMix2.5μL、引物混合液0.07μL。优选的，所述KASP反应的程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，自61℃开始退火并延伸进行10个循环，每个循环退火并延伸的温度降低0.6℃，每个循环退火并延伸的时间为60s；94℃变性20秒，55℃退火并延伸60秒，26个循环。本专利技术还提供了所述引物组或所述试剂盒或所述KASP标记检测方法在水稻种质资源鉴定中的应用。本专利技术还提供了所述引物组或所述试剂盒或所述KASP标记检测方法在水稻育种中的应用。本专利技术提供了检测水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的引物组，所述引物组包括：核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的正向引物、核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的反向引物和核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的通用引物。利用本专利技术所述引物组可筛选出检测水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的特异SNP位点，能够准确地鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B，显著提高氮高效种质资源的鉴定准确性和检测效率。在本专利技术实施例中，应用所述引物组的检测方法准确可靠，操作简便，减少了氮素利用率测定的规模和频率，降低了研发成本，缩短了育种进程，提高了育种效率。在分子辅助育种领域，为氮高效种质资源的创制和水稻氮高效新品种的培育提供了技术支撑。附图说明图1为水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的KASP标记分型图。具体实施方式本专利技术提供了检测水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的引物组，其特征在于，所述引物组包括：核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的正向引物、核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的反向引物和核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的通用引物。在本专利技术中，所述正向引物为Primer_Allele，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：CAGCCTCCACTTGCTCGCCA；反向引物为Primer_AlleleY，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示：AGCCTCCACTTGCTCGCCG；通用引物为Primer_Common，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示：GACAGGTCGGCGGCGGAGT。本专利技术还提供了一种鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的试剂盒，所述试剂盒中包含所述引物组，还包括：2×KASPMasterMix。本专利技术所述试剂盒中，所述引物组以引物组混合液的形式存在，以72×Assaymix表示。所述72×Assaymix可针对SNP位点扩增出特异的荧光序列。本专利技术还提供了一种硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的KASP标记检测方法，包括以下步骤:(1)提取待测样品和对照样品的全基因组DNA，以所述全基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物组或权利要求2所述试剂盒进行KASP反应，得KASP反应产物；(2)对所述KASP反应产物进行扫描，根据荧光颜色判断待测样品的基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.检测水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的引物组，其特征在于，所述引物组包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的通用引物。
【技术特征摘要】
1.检测水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的引物组，其特征在于，所述引物组包括：核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的正向引物、核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的反向引物和核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的通用引物。2.一种鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求1所述引物组，还包括：2×KASPMasterMix。3.一种硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的KASP标记检测方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)提取待测样品和对照样品的全基因组DNA，以所述全基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物组或权利要求2所述试剂盒进行KASP反应，得KASP反应产物；(2)对所述KASP反应产物进行扫描，根据荧光颜色判断待测样品的基因型，若待测样品产物荧光显示颜色与阳性对照相同，则待测水稻品种携带籼型NRT1.1B基因；若待测样品产物荧光显示颜色与阴性对照相同，则待测水稻品种含有...
【专利技术属性】
技术研发人员：李刚，袁彩勇，谢青轩，杨丹，王健，程保山，王迪，储成才，
申请(专利权)人：江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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