鹅星状病毒病毒样颗粒新型基因工程亚单位疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种免疫组合物，其包含采用序列如SEQ ID NO:1所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鹅星状病毒外衣壳结构蛋白。所述免疫组合物可应用为鹅星状病毒病毒样颗粒新型基因工程亚单位疫苗，其抗原表达水平较高，能够自发组装成病毒样颗粒(Virus like particles,VLPs)，免疫原性强，对鹅没有致病性，并且本发明专利技术的鹅星状病毒病毒样颗粒新型基因工程亚单位疫苗可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，也大大降低了疫苗生产成本。

New Genetically Engineered Subunit Vaccine of Goose Stellate Virus-like Particles

【技术实现步骤摘要】
鹅星状病毒病毒样颗粒新型基因工程亚单位疫苗
本专利技术涉及动物免疫药物
，具体而言，涉及一种鹅星状病毒病毒样颗粒新型基因工程亚单位疫苗。
技术介绍
星状病毒(Astroviridae，AstV)是一类无囊膜、呈球形、直径为28-30nm的单股正链RNA病毒。星状病毒科分为两个属，哺乳动物星状病毒属(Mamastrovirus)和禽星状病毒属(Avastrovirus)，禽星状病毒可以引起禽类发生多种疾病。鹅星状病毒(GooseAstV,GAstV)属于禽星状病毒3型，该病毒的感染具有一定的流行性，主要侵害幼龄雏鹅，以5-20日龄为主。鹅感染GAstV后，发病率高达80-90％，病程持续7-10天，主要症状为雏鹅痛风，死亡率20-70％，对肉鹅养殖业造成严重经济损失。目前鹅星状病毒使用抗病毒和抗菌治疗方法无效，并且尚无疫苗可以进行预防；常规弱毒活疫苗存在毒株毒力返强的风险，灭活疫苗存在自身免疫保护力较弱、灭活不完全、造成散毒的风险，因此，现有技术亟需一种安全高效能预防鹅星状病毒的新型基因工程疫苗，本专利技术因此而来。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种免疫组合物，其可以应用为鹅星状病毒病毒样颗粒基因工程亚单位疫苗，以解决现有技术中的问题。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种免疫组合物，包含：采用SEQIDNO:1的核酸分子或者与SEQIDNO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鹅星状病毒外衣壳结构蛋白。本专利技术进一步的技术方案是：所述的鹅星状病毒外衣壳结构蛋白包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或者与SEQIDNO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。本专利技术的另一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对鹅星状病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。本专利技术的又一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于预防鹅星状病毒感染的药剂的用途。本专利技术的又一目的在于提供一种核酸分子，其可以用于编码鹅星状病毒外衣壳结构蛋白，包含SEQIDNO:1的顺序核苷酸序列或者与SEQIDNO:1的核苷酸序列95％以上相同的顺序核苷酸序列。本专利技术的又一目的在于提供一种所述的核酸分子用于生产用于在受试动物中诱导针对鹅星状病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。本专利技术的又一目的在于提供一种所述的核酸分子用于生产用于预防动物受鹅星状病毒感染的药剂的用途。本专利技术的又一目的在于提供一种蛋白，其选自由以下组成的组：SEQIDNO:2、与SEQIDNO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的蛋白。本专利技术的又一目的在于提供一种适用于在受试动物体内产生针对鹅星状病毒的免疫反应的免疫组合物，包含：所述的鹅星状病毒外衣壳结构蛋白，和佐剂。本专利技术的又一目的在于提供所述的蛋白用于制备鹅星状病毒病毒样颗粒基因工程亚单位疫苗方面的应用。本专利技术的又一目的在于提供一种产生所述的蛋白的方法，其包括以下步骤：S1.制备用于编码鹅星状病毒外衣壳结构蛋白的核酸分子；S2.构建重组载体，将步骤S1所述的核酸转入重组质粒载体中；S3.将重组质粒载体与Sf9细胞混合，在转染试剂存在的条件下进行细胞转染；s4.在有利于表达所述鹅星状病毒外衣壳结构蛋白的条件下培育所述Sf9细胞；进而重组表达产生所述鹅星状病毒外衣壳结构蛋白。所述方法还包括：S5、将S4步骤中重组鹅星状病毒外衣壳结构蛋白加入到药学上可接受的载体中，得到所述免疫组合物。所述转移载体选自pFastBac1、pVL1393中的任意一种。步骤S3中，所述转染试剂为转染培养基稀释的Cellfectin。本专利技术目的在于提供一种免疫效果好、工艺更安全的鹅星状病毒基因工程亚单位疫苗，为达到以上目的，本专利技术使用Sf9细胞表达重组鹅星状病毒外衣壳结构蛋白Cap蛋白(capsidprotein)，该结构蛋白能够自发的形成VLPs(Viruslikeparticles)，形成的VLPs具有极好的免疫原型以及安全性，然后将VLPs制作疫苗，激发更强更全面的抗体保护。本专利技术公开了一种Sf9细胞表达的鹅星状病毒重组亚单位疫苗的制备方法和应用，并证明该疫苗能够在鹅体内产生较强的体液免疫，免疫后的鹅能够抵御星状病毒的感染，属于动物疫苗与兽用生物制品
，其目的在于提供一种可大规模工业化生产的鹅星状病毒重组亚单位疫苗的制备方法：1)重组杆状病毒构建：包含将GAstVCap蛋白的编码基因克隆到穿梭载体pFastBac1载体上得到重组穿梭载体，再将重组穿梭质粒转化到含有杆状病毒基因组Bacmid的DH10Bac菌中，重组穿梭载体中目的基因表达框定向插入bacmid中，获得含有目的基因表达框的重组Bacmid，将重组bacmid转染Sf9细胞获得重组杆状病毒；2)重组病毒的检测：包括转染收获产物的蛋白SDS-PAGE、WB检测，电镜检测以及病毒继代的免疫荧光检测、病毒滴度检测；3)重组蛋白大规模的生产：包括将获得的重组杆状病毒接种Sf9细胞在反应器中大规模生产目的蛋白并使用Elisa定量以及琼扩检测；4)疫苗制备以及疫苗效力检测。本专利技术提供的方法能够通过无血清全悬浮培养制备抗原蛋白，生产方便，也大大降低了疫苗生产成本。采用上述方案后，本专利技术与现有技术相比较具有以下突出的优点和效果：本专利技术的免疫组合物生产过程不涉及全病毒，通过Sf9细胞进行蛋白表达，表达的Cap蛋白能够自发的组装成VLPs，产品的抗原性、免疫原性强，表达水平较高。悬浮培养，易于大规模生产。本专利技术使用Sf9细胞表达Cap蛋白，产品的抗原性、免疫原性强，表达水平较高，对鹅没有致病性，并且本专利技术的疫苗可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，也大大降低了疫苗生产成本。本专利技术的亚单位疫苗可以大规模生产，供量充足，质控容易，安全性高，稳定性好，生产成本低。本专利技术使用了优化的Cap蛋白序列，使用悬浮培养Sf9细胞进行表达，表达水平较高，蛋白免疫原性好。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1为将Cap蛋白基因PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，可以看到一个2.1kbp的条带；其中1为AstV-Cap基因，2为阴性对照，M为分子量标记；图2为多个Cap蛋白基因转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，2.1kbp条带出现为阳性样品。其中1～5均为Cap蛋白基因转化的菌落样品PCR扩增后的产物，6为非阳性样品，M为分子量标记；图3为构建的含有目的基因的转移载体pF-Cap图谱；图4为实施例3中收获的细胞培养物上清进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果，rBac-Cap细胞培养物在分子量约106kDa附近出现目的条带；其中1为实施例3中收获的细胞培养物上清，2为阴性对照，M为分子量标记；图5为实施例4中SDS-PAGE电泳后的产物WesternBlot检测结果；其中1为组杆状病毒表达样品，2为阴性对照，M为分子量标记；图6为GAstV的Cap蛋白病毒样颗粒电镜图；图7为使用本专利技术疫苗后，攻毒后阴性对照组与疫苗组雏鹅解剖的对比结果。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本说明书使用的所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫组合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：S1、制备用于编码鹅星状病毒外衣壳结构蛋白的核酸分子，所述核酸分子为序列入SEQ ID NO:1所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子；S2、构建重组载体，将步骤S1的所述核酸分子克隆到转移载体中，得到含有目的基因的重组质粒载体；S3、将所述重组质粒载体与Sf9细胞混合，在转染试剂存在的条件下进行细胞转染；S4.在有利于表达所述鹅星状病毒外衣壳结构蛋白的条件下培育所述Sf9细胞，进而重组表达产生鹅星状病毒外衣壳结构蛋白；S5、将所述重组鹅星状病毒外衣壳结构蛋白加入到药学上可接受的载体中，得到所述免疫组合物。

【技术特征摘要】
1.一种免疫组合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：S1、制备用于编码鹅星状病毒外衣壳结构蛋白的核酸分子，所述核酸分子为序列入SEQIDNO:1所示的核酸分子或者与SEQIDNO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子；S2、构建重组载体，将步骤S1的所述核酸分子克隆到转移载体中，得到含有目的基因的重组质粒载体；S3、将所述重组质粒载体与Sf9细胞混合，在转染试剂存在的条件下进行细胞转染；S4.在有利于表达所述鹅星状病毒外衣壳结构蛋白的条件下培育所述Sf9细胞，进而重组表达产生鹅星状病毒外衣壳结构蛋白；S5、将所述重组鹅星状病毒外衣壳结构蛋白加入到药学上可接受的载体中，得到所述免疫组合物。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述转移载体选自pFastBac1、pVL1393中的任意一种。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述转染试剂为转染培养基稀释的Cellfectin。4.一种免疫组合物，其特征在于包含：采用SEQIDNO:1的核酸分子或者与SEQIDNO:1的...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹文龙，孔迪，滕小锘，易小萍，张大鹤，
申请(专利权)人：苏州世诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32