一种副溶血弧菌检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种副溶血弧菌检测试剂盒及其检测方法。该副溶血弧菌检测试剂盒包括如下组分：sCPA引物，和利用钼锑抗光度法检测磷酸根离子的相关试剂；sCPA引物包括如下序列：外引物4s、外引物5a、内引物3a、内引物2a、交叉引物CP。本发明专利技术将单交叉引物恒温扩增技术和检测磷酸根离子的钼锑抗光度法结合起来，实现了对副溶血弧菌的检测，具有快速、特异性强、高灵敏、可视化等特点。

A Kit for Detecting Vibrio parahaemolyticus and Its Detection Method

【技术实现步骤摘要】
一种副溶血弧菌检测试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及一种副溶血弧菌检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
食源性致病菌是指源于食品可引起疾病的微生物，也称食源性病原微生物，一般所说的致病菌指的是病原微生物中的细菌。副溶血性弧菌是一种常见的致病菌，其引起的中毒事件多发生在沿海地区，且多发生于夏季。副溶血弧菌的致病性常表现为三种类型，即由肠毒素引起的毒素型、活菌侵入肠黏膜引起的感染型以及两者同时引起的混合型。副溶血作为重大食品安全隐患，建立快速、高灵敏、简便的检测方法成为副溶血弧菌检测的必然趋势。近年来，随着分子生物学的迅猛发展，鉴定副溶血弧菌除了传统的分离鉴定法，主要有免疫学方法、分子生物学方法等。CPA方法是一种新型的等温扩增技术，该技术利用多个引物和探针进行等温扩增反应，其中一个或两个引物为交叉引物。根据交叉引物的的数量分为单交叉引物扩增和双交叉引物扩增。单交叉引物扩增技术(sCPA)的引物一般为5条，包括1条交叉引物，2条外引物(剥离引物)，2条内引物(正向引物)，并利用一种具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在恒温条件下反应一小时，即可特异、快速、高效地完成核酸扩增反应。鉴于CPA具有操作简单、速度快、特异性强和灵敏度高等优势，现己广泛应用于各个领域，如食品、环境、临床、工农业及畜牧业等。基于CPA技术的副溶血弧菌检测方法也有被报道，但均是与核酸试纸条结合，其他信号输出方式未见报道。磷酸根离子广泛存在于工业废水或生活污水当中，是造成水资源富营养化等环境问题的重要来源，同时国家对此制订了检测标准及规定，因此对磷酸根检测的研究和技术也很成熟。磷酸根的测定方法较多，如离子色谱法、钼锑抗光度法、钼蓝法、钒钼酸铵示差光度法等。其中，钼锑抗光度法是指在一定酸度和锑离子存在的情况下，磷酸根与钼酸铵形成锑磷钼混合杂多酸，它在常温下可迅速被抗坏血酸还原为钼蓝，在700nm波长下可测定。由于CPA反应过程中，产生大量焦磷酸根(PPi)，通过焦磷酸酶可将PPi转换为磷酸根(Pi)进行检测，从而间接检测CPA产物的量。目前，还未见针对副溶血弧菌的磷酸根可视化检测技术。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种副溶血弧菌检测试剂盒及其检测方法。本专利技术将单交叉引物恒温扩增技术和检测磷酸根离子的钼锑抗光度法结合起来，实现了对副溶血弧菌的检测，具有快速、特异性强、高灵敏、可视化等特点。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种副溶血弧菌检测试剂盒，包括如下组分：sCPA引物，和利用钼锑抗光度法检测磷酸根离子的相关试剂；sCPA引物包括如下序列：外引物4s：序列如SEQIDNO：1；外引物5a：序列如SEQIDNO：2；内引物3a：序列如SEQIDNO：3；内引物2a：序列如SEQIDNO：4；交叉引物CP：序列如SEQIDNO：5。本专利技术以副溶血弧菌为研究对象，利用NCBI数据库，筛选出了副溶血弧菌特异基因的序列。同时将单交叉引物恒温扩增和检测磷酸根离子的钼锑抗光度法结合起来，建立交叉引物扩增-磷酸根(CPAP)可视化检测法，实现了对副溶血弧菌的检测，具有快速、简单、准确、特异性强、高灵敏、可视化等特点，为快速检测食品中的副溶血弧菌提供了新的检测技术方法。作为优选，副溶血弧菌检测试剂盒还包括dNTPs、甜菜碱、PPase、MgSO4、缓冲液、BstDNA聚合酶及水。作为优选，利用钼锑抗光度法检测磷酸根离子的相关试剂包括钼酸铵、酒石酸锑钾、抗坏血酸和无机酸。作为优选，无机酸为H2SO4。本专利技术还提供了一种副溶血弧菌的检测方法，采用上述sCPA引物对副溶血弧菌的DNA进行扩增，采用检测磷酸根离子的相关试剂对扩增产物进行检测。作为优选，该检测方法的反应体系如下：优选地，该检测方法的反应体系如下：作为优选，扩增的反应程序为63℃下反应35min。在本专利技术中，对扩增产物进行检测的判定方法为：待显色之后观察颜色，溶液无色，则无副溶血弧菌；溶液呈现蓝色，则存在副溶血弧菌。作为优选，无机酸为H2SO4。本专利技术提供了一种副溶血弧菌检测试剂盒及其检测方法。该副溶血弧菌检测试剂盒包括如下组分：sCPA引物，和利用钼锑抗光度法检测磷酸根离子的相关试剂；sCPA引物包括如下序列：外引物4s：序列如SEQIDNO：1；外引物5a：序列如SEQIDNO：2；内引物3a：序列如SEQIDNO：3；内引物2a：序列如SEQIDNO：4；交叉引物CP：序列如SEQIDNO：5。本专利技术具有的技术效果为：(1)本专利技术首次利用单交叉引物设计CPAP方法检测副溶血弧菌，在sCPA扩增产物中加入PPase和显色剂，通过三个阴性对照(体系中同时只存在DNA模板和PPase之一；或同时不存在；用去离子水代替sCPA扩增产物)的空白吸光值基本相同，来说明只有sCPA反应有扩增产物产生，且产物中的PPi被PPase分解后产生Pi时才会显色证明该体系的可行性。(2)本专利技术提供利用单交叉CPA方法检测副溶血弧菌tlh特异基因的通用引物，具有表1所示的序列，引物具有良好特异性。(3)本专利技术通过检测磷酸根离子对sCPA反应产物进行分析，可准确判定样品DNA提取液中是含有副溶血弧菌，该方法快速，简单，可在35min内读取检测结果，结果易于观察，适用于基层食品监督检验使用。(4)在本专利技术的快速检测方法中，sCPA扩增反应可在恒定温度下完成，因此对温控的仪器设备要求不高，水浴器或板式加热器均可满足要求。(5)本专利技术的快速检测方法灵敏度高，副溶血弧菌特异基因tlh的的检测线为104copies。附图说明图1为鉴定副溶血弧菌tlh基因，泳道1：tlh；图2为CPAP方法原理；图3为验证副溶血弧菌CPAP检测法可行性的吸光度柱形图、电泳图，泳道M：DNAmarker；1和2：添加相同的DNA模板；3和4：不添加DNA模板；5和6：水代替扩增产物；1、3、5：添加PPase；2、4、6不添加PPase；图4为CPAP体系中Mg2+浓度优化的吸光度柱形图和颜色比对图；图5为CPAP体系中PPase酶量优化的吸光度柱形图和颜色比对图；图6为CPAP体系中H2SO4浓度优化的吸光度柱形图和颜色比对图；图7为CPAP体系中抗坏血酸浓度优化的吸光度柱形图和颜色比对图；图8为验证CPAP检测方法灵敏度结果图，△吸光值与副溶血弧菌拷贝数的线性关系；图9为验证CPAP检测方法特异性的吸光度柱形图和颜色比对图；图10为CPAP可视化检测法与磷酸根试纸条检测Pi产物的比对图。具体实施方式本专利技术公开了一种副溶血弧菌检测试剂盒及其检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术的目的是提供用于检测副溶血弧菌特异基因(tlh)为靶基因的CPAP快速检测方法。本专利技术采用的技术方案是：将单交叉引物恒温扩增技术和检测磷酸根离子的钼锑抗光度法结合起来检测副溶血弧菌特异基因，该检测方法包括菌种培养、模板DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种副溶血弧菌检测试剂盒，其特征在于，包括如下组分：sCPA引物，和利用钼锑抗光度法检测磷酸根离子的相关试剂；所述sCPA引物包括如下序列：外引物4s：序列如SEQ ID NO：1；外引物5a：序列如SEQ ID NO：2；内引物3a：序列如SEQ ID NO：3；内引物2a：序列如SEQ ID NO：4；交叉引物CP：序列如SEQ ID NO：5。

【技术特征摘要】
1.一种副溶血弧菌检测试剂盒，其特征在于，包括如下组分：sCPA引物，和利用钼锑抗光度法检测磷酸根离子的相关试剂；所述sCPA引物包括如下序列：外引物4s：序列如SEQIDNO：1；外引物5a：序列如SEQIDNO：2；内引物3a：序列如SEQIDNO：3；内引物2a：序列如SEQIDNO：4；交叉引物CP：序列如SEQIDNO：5。2.根据权利要求1所述的副溶血弧菌检测试剂盒，其特征在于，所述副溶血弧菌检测试剂盒还包括dNTPs、甜菜碱、PPase、MgSO4、缓冲液、BstDNA聚合酶及水。3.根据权利要求1所述的副溶血弧菌检测试剂盒，其特征在于，所述利用钼锑抗光度法检测磷酸根离子的相关试剂包括钼酸铵、酒石酸锑钾、抗坏血酸和无机酸。4.根据权利要求3所述的副溶血弧菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：许文涛，吕淑霞，罗云波，黄昆仑，李雪彤，粟元，贺晓云，杜再慧，朱龙佼，
申请(专利权)人：中国农业大学，沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11