非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒，属于体外核酸检测领域，所述非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒包括用于检测PNPLA3 rs738409C>G、TM6SF2 rs58542926C>T、GCKR rs780094T>C 3个SNP位点多态性的3对引物和3对探针。该非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒，检测结果与测序结果比较准确率100％，三管同时检测样本三个位点的纯合野生型、纯合突变型和杂合型；结果更易判断，结果可以通过分型软件准确分型，可通过荧光定量PCR曲线进行确认复核，准确可靠；不受样本例数的限制，可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷。

Non-alcoholic fatty liver susceptibility related gene detection kit

【技术实现步骤摘要】
非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒
本专利技术属于体外核酸检测领域，具体涉及一种非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒。
技术介绍
非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)，指的是与胰岛素抵抗和遗传易感有关的一类代谢应激性肝损伤疾病，包括非酒精性脂肪性肝变(non-alcoholichepaticsteatosis)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)、肝硬化和肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)。目前，随着肥胖症、2型糖尿病(type2diabetesmellitus,T2DM)和代谢综合征(metabolicsyndrome,MetS)等疾病的流行，与之密切相关的NAFLD已成为我国第一大慢性肝病和健康体检肝脏生化指标异常的首因。此外，乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)慢性感染者合并NAFLD也愈发常见，严重危害国民生命健康和生活质量。研究发现，NAFLD具有家族聚集性及遗传倾向。欧洲肝病学会非酒精性脂肪性肝病临床实践指南《EASL-EASD-EASOClinicalPracticeGuidelinesfortheManagementofNon-AlcoholicFattyLiverDisease》中指出，PNPLA3和TM6SF2等相关基因位点上的突变会增加非酒精性脂肪性肝病发病及恶化的风险。此外，亚洲地区非肥胖症人群(BMI<25kg/m2)中NAFLD的流行率约为20％，导致其发病的众多因素中遗传风险的影响可能比肥胖症人群更大。目前通过全基因组关联研究(GWAS)发现大量与各种常见疾病相关的遗传学标志位点，数十个与NAFLD有关联的遗传易感性位点被发现，根据人群地域的不同这些位点的风险大小也不同。各项研究结果显示部分易感位点在NAFLD的发生和发展过程中可能发挥着重要作用，主要有PNPLA3rs738409C>G、TM6SF2rs58542926C>T、GCKRrs780094T>C等。PNPLA3，Patatin样磷脂酶域蛋白3，主要在脂肪细胞和肝细胞中表达，编码脂肪滋养蛋白，该蛋白具有脂肪酶和甘油转乙酰酶活性，调节肝脏甘油三酯代谢。rs738409C>G突变导致PNPLA3蛋白的148位氨基酸由异亮氨酸变为蛋氨酸，阻止底物与酶活性位点的结合，脂肪水解活性下降，引起甘油三酯在肝脏细胞内蓄积。TM6SF2，跨膜蛋白6超家族成员2，在脑组织、肾脏、肝脏及小肠表达。TM6SF2rs58542926C>T的转化导致第167位谷氨酸残基被赖氨酸残基替换，影响TM6SF2编码的蛋白质功能，有研究猜测突变型的蛋白由于表达异常在细胞内加速降解，突变型蛋白量减少，甘油三酯沉积在肝脏中使肝脏中脂质含量增多，导致肝脏发生脂肪变性引起肝病，并逐步发展为严重肝纤维化或者肝硬化、甚至肝细胞癌的发生。GCKR基因编码的葡萄糖激酶调节蛋白，是葡萄糖激酶(glucokinase,GCK)的变构抑制剂，而GCK是肝脏细胞葡萄糖代谢过程中的关键酶。rs780094位点位于GCKR基因的增强子上，等位基因T会引发葡萄糖激酶调节蛋白表达量下调，对GCK活性的抑制能力减弱，导致肝细胞内的葡萄糖在GCK催化下过度转化为甘油三酯并在细胞内堆积，最终引发脂肪肝。因此，通过检测PNALA3基因、TM6SF2基因和GCKR基因及其相关位点，可以知道被检者的非酒精性脂肪肝易感风险程度的高低，从而根据检测结果对被检者进行个体化的NAFLD防治指导建议，对于防治NAFLD及其并发疾病、改善被检者生活质量具有重要意义。目前，检测NAFLD易感基因位点多态性的试剂盒有检测单个位点的，也有检测多个位点组合的。仅检测单个位点基因型不能全面评估NAFLD的易感风险；而检测多个位点的试剂盒使用的方法为一代测序法，该方法需要对扩增后的样品进行纯化、再次扩增分析序列，检测步骤繁琐、复杂，对环境及操作人员要求较高、需要昂贵的仪器设备、成本高，在临床上具有一定的限制。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒，包括用于检测PNPLA3rs738409C>G、TM6SF2rs58542926C>T、GCKRrs780094T>C3个SNP位点多态性的3对引物和3对探针；所述用于检测PNPLA3rs738409C>G的引物和探针的序列如SEQIDNo：1、SEQIDNo：2、SEQIDNo：7和SEQIDNo：8所示；所述用于检测TM6SF2rs58542926C>T的引物和探针的序列如SEQIDNo：3、SEQIDNo：4、SEQIDNo：9和SEQIDNo：10所示；所述用于检测GCKRrs780094T>C的引物和探针的序列如SEQIDNo：5、SEQIDNo：6、SEQIDNo：11和SEQIDNo：12所示。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒，是一种用于PNPLA3、TM6SF2、GCKR基因多态性的检测试剂盒，试剂盒中包含的用于检测PNPLA3rs738409C>G、TM6SF2rs58542926C>T、GCKRrs780094T>C3个SNP位点多态性的3对引物和3对探针，检测结果与测序结果准确率高达100％，可三管同时检测样本的三个位点的纯合野生型、纯合突变型和杂合型；相比使用ΔCt值法的判断结果更易判断，结果可以通过分型软件准确分型，还可以通过荧光定量PCR曲线进行确认复核，结果准确可靠；本专利技术提供的非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒不受样本例数的限制，可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷。附图说明图1所示为本专利技术具体实施方式的PNPLA3rs738409C>G野生纯合型的扩增曲线；图2所示为本专利技术具体实施方式的PNPLA3rs738409C>G杂合型的扩增曲线；图3所示为本专利技术具体实施方式的PNPLA3rs738409C>G突变纯合型的扩增曲线；图4所示为本专利技术具体实施方式的TM6SF2rs58542926C>T野生纯合型的扩增曲线；图5所示为本专利技术具体实施方式的TM6SF2rs58542926C>T杂合型的扩增曲线；图6所示为本专利技术具体实施方式的TM6SF2rs58542926C>T突变纯合型的扩增曲线；图7所示为本专利技术具体实施方式的GCKRrs780094T>C野生纯合型的扩增曲线；图8所示为本专利技术具体实施方式的GCKRrs780094T>C杂合型的扩增曲线；图9所示为本专利技术具体实施方式的GCKRrs780094T>C突变纯合型的扩增曲线；图10所示为本专利技术具体实施方式的PNPLA3rs738409位点检测样本分型结果图；图11所示为本专利技术具体实施方式的TM6SF2rs58542926位点检测样本分型结果图；图12所示为本专利技术具体实施方式的GCKRrs780094位点检测样本分型结果图。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒，其特征在于，包括用于检测PNPLA3 rs738409 C>G、TM6SF2 rs58542926 C>T、GCKR rs780094 T>C3个SNP位点多态性的3对引物和3对探针；所述用于检测PNPLA3 rs738409 C>G的引物和探针的序列如SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：7和SEQ ID No：8所示；所述用于检测TM6SF2 rs58542926 C>T的引物和探针的序列如SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：9和SEQ ID No：10所示；所述用于检测GCKR rs780094 T>C的引物和探针的序列如SEQ ID No：5、SEQ ID No：6、SEQ ID No：11和SEQ ID No：12所示。

【技术特征摘要】
1.非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒，其特征在于，包括用于检测PNPLA3rs738409C>G、TM6SF2rs58542926C>T、GCKRrs780094T>C3个SNP位点多态性的3对引物和3对探针；所述用于检测PNPLA3rs738409C>G的引物和探针的序列如SEQIDNo：1、SEQIDNo：2、SEQIDNo：7和SEQIDNo：8所示；所述用于检测TM6SF2rs58542926C>T的引物和探针的序列如SEQIDNo：3、SEQIDNo：4、SEQIDNo：9和SEQIDNo：10所示；所述用于检测GCKRrs780094T>C的引物和探针的序列如SEQIDNo：5、SEQIDNo：6、SEQIDNo：11和SEQIDNo：12所示。2.根据权利要求1所述的非酒精性脂肪肝易感相关基因检测试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液1、PCR反应液2和PCR反应液3；所述PCR反应液1包括用于检测PNPLA3rs738409C>G的引物和探针；所述PCR反应液2包括用于检测TM6SF2rs58542926C>T的引物和探针；所述PCR反应液3包括用于检测GCKRrs780094T>C的引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛怡婷，
申请(专利权)人：阿吉安福州基因医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35