一种胆固醇含量检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提出一种胆固醇含量检测试剂盒及检测方法，属于胆固醇含量检测技术领域，其检测灵敏度高、特异性强、线性范围宽，而且，该胆固醇含量检测试剂盒中的各试剂均较为稳定，易于储存。该胆固醇含量检测试剂盒，包括如下试剂：氢氧化钾乙醇溶液、正己烷水溶液、Triton X‑100异丙醇溶液、溶液A、胆固醇氧化酶溶液、氧化镨溶液和荧光标记DNA探针溶液；其中，所述溶液A包含缓冲液。

A Kit for Detecting Cholesterol Content and Its Detection Method

【技术实现步骤摘要】
一种胆固醇含量检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于胆固醇含量检测
，尤其涉及一种胆固醇含量检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
目前，国内外实验室中，通常都是采用商品化的酶法试剂盒在全自动仪器上检测血清中总胆固醇含量(totalcholesterol，TC)。酶法检测血清TC的原理是以胆固醇酯酶水解胆固醇酯为游离胆固醇，以胆固醇氧化酶氧化胆固醇生成4-烯胆甾烷酮和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下与酚类或苯胺类化合物及4-氨基安替比林或其类似物发生氧化、缩合反应，产生最大吸收波长为500～600nm的醌亚胺类化合物(Trinder反应)，在一定浓度范围内，醌亚胺类化合物的浓度与血清TC浓度呈正比，进而通过检测醌亚胺类化合物含量获得血清TC浓度。然而，现有酶法检测血清TC的灵敏度和特异性比较低，线性范围较窄，不能满足高浓度的胆固醇检测，在检测高浓度胆固醇时必须进行一定倍数的稀释，而且，天然酶不易储存、易变性。因此，如何提供一种灵敏度高、特异性强、线性范围宽、稳定的胆固醇含量检测试剂盒及检测方法，是当前急需解决的一项技术难题。
技术实现思路
本专利技术针对上述的技术难题，提出一种胆固醇含量检测试剂盒及检测方法，其检测灵敏度高、特异性强、线性范围宽，而且，该胆固醇含量检测试剂盒中的各试剂均较为稳定，易于储存。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：本专利技术提供了一种胆固醇含量检测试剂盒，包括如下试剂：氢氧化钾乙醇溶液、正己烷水溶液、TritonX-100异丙醇溶液、溶液A、胆固醇氧化酶溶液、氧化镨溶液和荧光标记DNA探针溶液；其中，所述溶液A包含缓冲液。作为优选，所述溶液A还包括氯化钠。作为优选，所述荧光标记DNA探针为5’端用FAM标记的腺嘌呤五聚体，所述腺嘌呤五聚体的序列为5’-AAAAA-3’。作为优选，所述缓冲液为Hepes缓冲液或醋酸缓冲液。作为优选，所述氢氧化钾乙醇溶液的浓度为7-10mmol/L；所述正己烷水溶液中正己烷的体积百分比为60％-70％；所述TritonX-100异丙醇溶液中TritonX-100的体积百分比为30％-50％；所述溶液A中缓冲液的浓度为5-20mmol/L，pH为7-8；所述胆固醇氧化酶溶液的浓度为2-10mg/mL；所述氧化镨溶液的浓度为16-166μmol/L；所述荧光标记DNA探针溶液的浓度为5-10nmol/L。作为优选，所述氢氧化钾乙醇溶液的浓度为8.9mmol/L；所述正己烷水溶液中正己烷与水的体积比为2:1；所述TritonX-100异丙醇溶液中TritonX-100与异丙醇的体积比为2:3；所述溶液A中缓冲液的浓度为10mmol/L，pH为7.6；所述胆固醇氧化酶溶液的浓度为5mg/mL；所述氧化镨溶液的浓度为66μmol/L；所述荧光标记DNA探针溶液的浓度为6nmol/L。作为优选，所述溶液A中氯化钠的浓度为30-200mmol/L。作为优选，所述溶液A中氯化钠的浓度为150mmol/L。本专利技术还提供了一种胆固醇含量检测方法，使用上述任一项技术方案所述的胆固醇含量检测试剂盒进行检测，包括如下步骤：血清样品预处理：向待测血清样品中加入氢氧化钾乙醇溶液以水解血清样品中的胆固醇酯；加入正己烷水溶液进行提取，并对提取液进行分离，得到血清样品提取物；用TritonX-100异丙醇溶液溶解血清样品提取物，得到预处理后的血清样品；配制胆固醇标准溶液和加标血清样品：用溶液A配制系列浓度的胆固醇标准溶液；用溶液A将预处理后的血清样品稀释500倍，取稀释后的血清样品分别加入到系列浓度的胆固醇标准溶液中，得到系列加标血清样品；配制检测剂：将氧化镨溶液与荧光标记DNA探针溶液混合，二者反应后得到检测剂；采用标准加入法测量胆固醇含量：将系列浓度的胆固醇标准溶液以及系列加标血清样品，分别与胆固醇氧化酶溶液混合，置于黑暗条件下温育，向各混合液中分别加入检测剂，得到系列空白标准检测样品和系列加标检测样品；对系列空白标准检测样品和系列加标检测样品分别进行荧光强度检测，分别绘制得到空白标准曲线和加标标准曲线；根据空白标准曲线和加标标准曲线，采用曲线延长法计算获得待测血清样品中胆固醇含量。作为优选，血清样品预处理步骤中，待测血清样品、氢氧化钾乙醇溶液、正己烷水溶液、TritonX-100异丙醇溶液的体积比为1:9:30:1；水解胆固醇酯时，在37℃下振荡进行，水解时间为1h；对提取液进行分离的具体步骤为：在5000rpm下对提取液离心处理5min，离心后取上清液，将上清液置于氮气气流下蒸干溶剂。作为优选，配制系列加标血清样品时，稀释后的血清样品与胆固醇标准溶液的体积比为2:3。作为优选，配制检测剂时，所述氧化镨溶液和荧光标记DNA探针溶液的体积比为3:2，反应时间为30min。作为优选，采用标准加入法测量胆固醇含量步骤中，采用标准加入法测量胆固醇含量步骤中，制备系列空白标准检测样品时加入的胆固醇标准溶液、胆固醇氧化酶溶液和检测剂的体积比为1:1:25，制备系列加标检测样品时加入的加标血清样品、胆固醇氧化酶溶液和检测剂的体积比为1:1:25；制备系列空白标准检测样品和系列加标检测样品时，在黑暗条件下温育时间为1h；系列空白标准检测样品和系列加标检测样品在进行荧光强度检测前，需室温静置1h；进行荧光强度检测的具体步骤为：在485nm激发波长下收集502-700nm的荧光光谱。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：1、本专利技术提供的胆固醇含量检测试剂盒中，以氢氧化钾乙醇溶液水解胆固醇酯，以正己烷水溶液作为提取胆固醇的提取溶剂，以TritonX-100异丙醇溶液作为细胞裂解液，以胆固醇氧化酶溶液氧化胆固醇，以氧化镨与荧光标记DNA探针混合后作为检测剂，提供了一种全新的胆固醇含量检测试剂盒，基于氧化镨可淬灭荧光标记DNA探针的荧光信号，而胆固醇氧化生成的过氧化氢与氧化镨反应后可恢复荧光标记DNA探针的荧光信号的原理，通过检测恢复的荧光信号强度即可测得胆固醇含量，检测灵敏度更高、特异性更强、线性范围更宽；2、本专利技术提供的胆固醇含量检测试剂盒中，采用的氧化镨为金属过氧化物纳米酶，相比于传统酶法检测试剂盒中的天然酶，其催化效率更高、更稳定，能适应更大范围的pH和温度变化，更易于储存；3、本专利技术提供的胆固醇含量检测试剂盒中，添加的氯化钠能够增强荧光恢复强度，有利于提高试剂盒的检测灵敏度；4、本专利技术提供的胆固醇含量检测方法，利用氢氧化钾乙醇溶液、正己烷水溶液和TritonX-100异丙醇溶液相配合对待测血清样品进行预处理，实现了对待测血清样品中胆固醇的充分提取，进而采用标准加入法，以氧化镨溶液与荧光标记DNA探针溶液混合后得到的荧光淬灭的混合液作为检测剂，利用胆固醇氧化酶溶液分别对系列浓度的胆固醇标准溶液以及系列加标血清样品中的胆固醇进行氧化反应，利用反应液对检测剂的荧光进行恢复，通过检测恢复后的荧光强度测定胆固醇含量，相比于现有酶法，该胆固醇含量检测方法的检测灵敏度高，特异性强，线性范围宽。附图说明图1为本专利技术实施例所提供的胆固醇含量检测方法的流程图；图2为本专利技术实施例所提供的不同浓度的氧化镨溶液与荧光标记DNA探针溶液混合反应后的荧光强度对比图；图3为本专利技术实施例所提供的氧化镨溶液与荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胆固醇含量检测试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：氢氧化钾乙醇溶液、正己烷水溶液、Triton X‑100异丙醇溶液、溶液A、胆固醇氧化酶溶液、氧化镨溶液和荧光标记DNA探针溶液；其中，所述溶液A包含缓冲液。

【技术特征摘要】
1.一种胆固醇含量检测试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：氢氧化钾乙醇溶液、正己烷水溶液、TritonX-100异丙醇溶液、溶液A、胆固醇氧化酶溶液、氧化镨溶液和荧光标记DNA探针溶液；其中，所述溶液A包含缓冲液。2.根据权利要求1所述的胆固醇含量检测试剂盒，其特征在于：所述溶液A还包括氯化钠。3.根据权利要求1或2所述的胆固醇含量检测试剂盒，其特征在于：所述荧光标记DNA探针为5’端用FAM标记的腺嘌呤五聚体，所述腺嘌呤五聚体的序列为5’-AAAAA-3’。4.根据权利要求1或2所述的胆固醇含量检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为Hepes缓冲液或醋酸缓冲液。5.根据权利要求1或2所述的胆固醇含量检测试剂盒，其特征在于：所述氢氧化钾乙醇溶液的浓度为7-10mmol/L；所述正己烷水溶液中正己烷的体积百分比为60％-70％；所述TritonX-100异丙醇溶液中TritonX-100的体积百分比为30％-50％；所述溶液A中缓冲液的浓度为5-20mmol/L，pH为7-8；所述胆固醇氧化酶溶液的浓度为2-10mg/mL；所述氧化镨溶液的浓度为16-166μmol/L；所述荧光标记DNA探针溶液的浓度为5-10nmol/L。6.根据权利要求5所述的胆固醇含量检测试剂盒，其特征在于：所述溶液A中氯化钠的浓度为30-200mmol/L。7.一种胆固醇含量检测方法，其特征在于，使用权利要求1-6任一项所述的胆固醇含量检测试剂盒进行检测，包括如下步骤：血清样品预处理：向待测血清样品中加入氢氧化钾乙醇溶液以水解血清样品中的胆固醇酯；加入正己烷水溶液进行提取，并对提取液进行分离，得到血清样品提取物；用TritonX-100异丙醇溶液溶解血清样品提取物，得到预处理后的血清样品；配制胆固醇标准溶液和加标血清样品：用溶液A配制系列浓度的胆固醇标准溶液；用溶液A将预处理后的血清样品稀释500倍，取稀释后的血清样...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜磊，刘涵云，冯卫华，陈钰雪，刘智宾，杨丽敏，
申请(专利权)人：中国石油大学华东，
类型：发明
国别省市：山东,37