一种用于眼表刺激性评价的重组角膜模型及其制备方法技术

一种用于眼表刺激性评价的重组角膜模型及其制备方法，具体涉及体外器官培养与组织再生领域。本发明专利技术从种子细胞角度出发，通过体外富集和扩增角膜缘干细胞进行三维角膜上皮模型的构建，既实现了种子细胞为角膜系，保证了眼刺激评价的体外体内一致性，也解决了产业化大规模生产问题，有利于眼表刺激体外替代实验的推行。

A Recombinant Corneal Model for Evaluating Eye Surface Stimulation and Its Preparation Method

【技术实现步骤摘要】
一种用于眼表刺激性评价的重组角膜模型及其制备方法
一种用于眼表刺激性评价的重组角膜模型及其制备方法，具体涉及体外器官培养与组织再生领域。
技术介绍
近年来，随着体外器官培养技术的发展，基于体外细胞培养构建的3D重组角膜模型，在临床替代损伤角膜结构，进行眼角膜损伤性修复的治疗方面具有显著功效。但由于其临床目应用主要是替代角膜损伤组织进行进行移植，多以开放式片状形式生产，并且是生物材料和不同类型种子细胞体外复合形成的三维空间复合体，因此整个角膜组织的结构及通透性方面都发生了改变，而化学品眼刺激性评价需要模仿化学品在眼表的渗透过程，要求在边缘无渗漏的密闭体系下进行，且应用于评价的重组角膜模型需要形成紧密的细胞连接才能体外模仿化学品在人体眼表的渗透特性，而给出准确的刺激性评价结果。因此，当前临床上应用的重组角膜无法进行化学品的眼刺激性体外替代评价。基于以上背景，建立和开发类似于人体角膜上皮的细胞三维结构，不仅可以更为真实的反映人体对化学物的响应，准确给出化学物刺激性的预测，对于化合物筛选的种类也具有更宽的应用范畴，除了不同功效目的的剂型开发，也包括化妆品具体成分的危害评价。目前，国际上针对化学品眼刺激性评价的体外重组角膜上皮模型主要有三种商业化的产品，EpiOcular™(MatTek,MA,USA)，HCE(SkinEthic,France)以及CORNEA-MODEL（Labcyte，Japen）。其中EpiOcularTM以人源的皮肤角质形成细胞作为种子细胞，体外培养形成类似于角膜上皮结构的模型。HCE模型采用永生化的角膜上皮细胞系作为种子细胞进行培养形成的多细胞层的角膜上皮组织类似物，结构上和角膜黏膜非常类似。虽然两款模型在眼刺激性动物替代评价方法中扮演重要的角色，但是EpiOcular的非角膜细胞系和HCE模型的永生化细胞系并不能完全意义上等同于人角膜，因此，对于体外模拟化学物对角膜刺激性的精确复制还有待考量。LabcyteCORNEA-MODEL采用正常的人角膜上皮细胞系进行构建，体外培养形成角膜上皮结构。角膜上皮细胞是体外研究细胞分化，信号传导、细胞稳态信号通路的模式工具，也可以用来进行体外三维的角膜上皮组织模型，但是可用角膜组织的有限来源，角膜细胞自身短暂的生命周期以及快速的分化使得角膜上皮细胞体外培养难度大，且非常耗时。因此，采用角膜上皮细胞进行三维角膜模型的体外构建如果不解决种子细胞自身的问题，将仅限于实验室培养，而无法进行产业化，许多尝试增长角膜上皮细胞体外培养周期的工作都有开展，例如病毒转染，端粒酶逆转录基因转染等，但是这些永生化的细胞系因为其异常的基因表型和致瘤的潜在风险而无法应用于生物学中角膜模型的构建。
技术实现思路
本专利技术从种子细胞角度出发，通过体外富集和扩增角膜缘干细胞进行三维角膜上皮模型的构建，既实现了种子细胞为角膜系，保证了眼刺激评价的体外体内一致性，也解决了产业化大规模生产问题，有利于眼表刺激体外替代实验的推行。因此，本专利技术旨在提供一种可在体外模拟实现角膜缘干细胞培养、扩增及用其构建三维角膜上皮模型的方法。此外本专利技术也提供一种可用于体外模拟角膜缘干细胞微环境的角膜基质微粒的制备方法。解决上述问题，采用的技术方案如下：一、制备脱细胞角膜基质选取包含有前弹力层的动物源性角膜，将其置于添加抗生素的、温度在2～30℃的去离子水中浸泡，对其进行脱细胞处理，具体方法可参考专利CN104971384A中的方法。将获取的脱细胞动物源性的角膜材料置于削切机中，切削获取角膜基质层。并对角膜基质层进行去抗原、病毒灭活处理。二、制备角膜基质微载体微载体是一种新兴的大规模细胞培养技术,是当前贴壁依赖型细胞大规模培养的主要方法。它具有均相培养兼具平板培养和悬浮培养的优势,培养条件(温度、pH值、二氧化碳浓度等)容易控制，并且培养过程系统化、自动化，不易被污染。采用角膜基质层做为角膜缘干细胞生长微环境的替代物，提供细胞生长微环境。角膜基质由200多层胶原纤维板构成，含有胶原，硫酸软骨素，硫酸角质素等胞外基质的主要成分，扮演着为角膜上皮细胞提供类似间质营养器的作用，完整的角膜基质含有复合生长因子，可诱导细胞增殖，生长和分化，提供细胞生长的微环境。有利于角膜缘干细胞的增殖，降低角膜缘干细胞的凋亡率，本专利技术将角膜基质制备成微球载体，体外模拟角膜缘干细胞三维的微环境，实现角膜缘干细胞的大规模扩增。具体方法如下：将步骤一中获取的脱细胞角膜基质层，采用去离子水进行冲洗3～5次，浸没于2～4℃的去离子水中置于超声波清洗仪中进行超声，超声波在液体中的分散效应，能够使液体产生空化的作用，从而使液体中的固体片状物、颗粒或细胞组织破碎。因此可借助超声波能量使干燥的角膜基质片形成裂缝，产生匀质化裂解的角膜基质碎片微粒，超声频率控制在25kHZ～40kHZ范围之内，频率过低较难实现裂缝形成，频率较高可能会影响角膜基质内部超微结构，影响后续的实验效果。将角膜基质碎片微粒置于冷冻干燥仪中进行低温冻干，制成脱细胞角膜基质微载体。将角膜基质微载体一次进行80目和100目的筛网过滤，获得直径约为100～200μm的微载体，以上所有操作均在无菌条件下进行。三、培养扩增角膜缘干细胞采用步骤二中的角膜基质微载体进行角膜缘干细胞的体外扩增和培养，方法如下：3.1)制备角膜缘干细胞将来自于眼库的眼球采用含质量分数为1%的庆大霉素的生理盐水浸泡30分钟，将角膜沿角膜缘剪下，得到角膜缘组织。用D-Hank’s液漂洗角膜缘组织两只三次。将清洗好的角膜缘组织剪成2mm见方的组织块，加入0.25%的胰蛋白酶，37℃消化5～8分钟，采用含有10%胎牛血清的DMED终止消化。离心，收集细胞。采用DMEM进行细胞重悬，制成1E4～2E4/ml的角膜缘干细胞细胞悬液，备用；3.2)体外培养、扩增角膜缘干细胞取上述角膜缘干细胞细胞悬液10ml与步骤二中制备的角膜基质微载体200mg注入容量为30ml的旋转培养系统，转速设定为20～30转/分钟，每天采用新鲜的DMEM进行换液，培养至细胞融合度为80%，排干细胞培养液，采用磷酸盐缓冲液清晰一至两遍后，弃去缓冲液，加入0.25%的胰蛋白酶，调整转速至50～70转/分钟，旋转5～10分钟进行细胞收集和获取，完成角膜缘干细胞的体外扩增。四、构建体外重角膜上皮模型4.1）将步骤三中获得的角膜缘干细胞采用培养液SK1进行重悬，接种于底面积为0.5cm2的细胞小室中，接种密度为0.2×105～0.5×105个/cm2，保持该细胞小室内的液量为150～200μl，在5%CO2、36～37℃的细胞培养箱中孵育24～48小时。本步骤也可以采用角膜缘干细胞和角膜上皮细胞按照1:1或者大于1:1的比例混合进行。所述构建培养液SKc1是在DMEM培养液中添加体积比分别为5～10%的胎牛血清FBS，0.1～0.5ng/ml的EGF，0.1～0.8μg/ml的地塞米松，3～25μg/L的胰岛素INSULIN，15～45μg/ml的腺嘌呤，0.1～0.5nM的ThyroxineT3，4～10μg/ml的维甲酸；4.2）培养2～3d后，更换成构建培养液SK2，并进行气液面培养，将步骤4.1）中细胞小室内的培养液吸去，保持构建模型面表的干燥本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于眼表刺激性评价的重组角膜模型，其特征在于：含有4～6层角膜上皮细胞，采用角膜缘干细胞又不仅限于角膜缘干细胞的角膜系上皮细胞为种子细胞。

【技术特征摘要】
1.一种用于眼表刺激性评价的重组角膜模型，其特征在于：含有4～6层角膜上皮细胞，采用角膜缘干细胞又不仅限于角膜缘干细胞的角膜系上皮细胞为种子细胞。2.一种用于眼表刺激性评价的重组角膜模型的制备方法，其特征在于：采用角膜基质层制备基质微粒，结合旋转培养体系体外模拟角膜缘干细胞生长微环境扩增角膜。3.根据权利要求2所述的一种用于眼表刺激性评价的重组角膜模型的制备方法，其特征在于，采用角膜缘干细胞作为种子细胞，制备角膜上皮细胞体外培养的条件培养基，通过不同的条件培养基诱导角膜缘干细胞体外增殖和分化。4.根据权利要求3所述的一种用于眼表刺激性评价的重组角膜模型的制备方法，其特征在于，具体方法步骤如下：1)制备角膜缘干细胞将来自于眼库的眼球采用含质量分数为1%的庆大霉素的生理盐水浸泡30分钟，将角膜沿角膜缘剪下，得到角膜缘组织；用D-Hank’s液漂洗角膜缘组织两只三次；将清洗好的角膜缘组织剪成2mm见方的组织块，加入0.25%的胰蛋白酶，37℃消化5～8分钟，采用含有10%胎牛血清的DMED终止消化；离心，收集细胞；采用DMEM进行细胞重悬，制成1E4～2E4/ml的角膜缘干细胞细胞悬液，备用；2)体外培养、扩增角膜缘干细胞取上述角膜缘干细胞细胞悬液10ml与步骤二中制备的角膜基质微载体200mg注入容量为30ml的旋转培养系统，转速设定为20～30转/分钟，每天采用新鲜的DMEM进行换液，培养至细胞融合度为80%，排干细胞培养液，采用磷酸盐缓冲液清晰一至两遍后，弃去缓冲液，加入0.25%的胰蛋白酶，调整转速至50～70转/分钟，旋转5～10分钟进行细胞收集和获取，完成角膜缘干细胞的体外扩增；3）构建体外重角膜上皮模型3.1）将步骤三中获得的角膜缘干细胞采用培养液SK1进行重悬，接种于底面积为0.5cm2的细胞小室中，接种密度为0.2×105～0....

【专利技术属性】
技术研发人员：李潇，卢永波，邓志宏，
申请(专利权)人：广东博溪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44