一种外源ABA处理对番茄花粉成熟的细胞学影响的探究方法技术

本发明专利技术公开了一种外源ABA处理对番茄花粉成熟的细胞学影响的探究方法，涉及农业技术领域，其包括以下步骤：S1、样本准备：番茄澳粉208自交系为实验样本；S2、试剂准备：脱落酸(ABA)：a,0μM浓度的ABA；b,10μM浓度的ABA；c,100μM浓度的ABA；d,1000μM浓度的ABA；甲二氢愈创木酸(NDGA)：e,0μM浓度的NDGA；f,10μM浓度的NDGA；g,100μM浓度的NDGA；h,1000μM浓度的NDGA。本文分别以不同浓度的ABA及NDGA溶液处理番茄花药，以探索引起花粉败育的有效药剂浓度，研究结果将为进一步阐明ABA调控植物雄蕊发育的分子机制、揭示雄性不育的调控机理同时也为ABA相关的雄性不育在育种工作中的应用提供一定的理论基础。

A Study on Cytological Effects of Exogenous ABA Treatment on Pollen Maturity of Tomato

【技术实现步骤摘要】
一种外源ABA处理对番茄花粉成熟的细胞学影响的探究方法
本专利技术涉及农业
，具体为一种外源ABA处理对番茄花粉成熟的细胞学影响的探究方法。
技术介绍
花粉的成熟对植物的繁衍，尤其对农作物的产量和品质都有决定性的影响。花粉的成熟受极其复杂的激素网络调控，其中脱落酸对花粉成熟的调控机理尚不清楚。番茄为雌雄同花植物，通常由雌雄性配子的结合进行繁殖。雄蕊的正常发育对于番茄繁衍、种质资源存续，尤其产量有决定性影响。然而，雄性不育的发现、研究和利用有效推动了多种农作物杂交种的应用和推广，雄性不育在作物育种中具有重要发展潜力和应用价值。番茄雄性不育分为花粉败育型、雄蕊退化型及功能不育型，目前番茄雄性不育基因虽然已定位到各条染色体，但尚需进一步精细定位，影响番茄雄性不育的因素繁多，如激素、环境、物质代谢和能量代谢等，目前，番茄雄性不育的调控研究主要为生理生化水平方面，其分子机制研究不多，特别是脱落酸对雄性不育影响的分子机理尚不清楚。为探究脱落酸在花粉成熟过程中的作用，更好的了解其对农作物产量和品质的影响，本专利技术提供一种外源ABA处理对番茄花粉成熟的细胞学影响的探究方法。
技术实现思路
(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种外源ABA处理对番茄花粉成熟的细胞学影响的探究方法，解决了现在尚不清楚脱落酸对花粉成熟的调控机理，不能精确通过脱落酸控制农产品的品质和产量的问题。(二)技术方案为达到以上目的，本专利技术采取的技术方案是：一种外源ABA处理对番茄花粉成熟的细胞学影响的探究方法，包括以下步骤：S1、样本准备：番茄澳粉208自交系为实验样本；S2、试剂准备：脱落酸(ABA)：a,0μM浓度的ABA；b,10μM浓度的ABA；c,100μM浓度的ABA；d,1000μM浓度的ABA；甲二氢愈创木酸(NDGA)：e,0μM浓度的NDGA；f,10μM浓度的NDGA；g,100μM浓度的NDGA；h,1000μM浓度的NDGA；将以上试剂分别放入备用器皿中，方便后续使用；S3、试剂使用后对正常花粉的百分率检测(1)选取小孢子时期的花蕾，使用注射器取药液用针头轻轻掰开萼片，将药液注入花药处；(2)将花蕾立即放入FAA固定液，真空抽气20-30Min，固定24h后进行石蜡切片制作；(3)经FAA固定液固定的样品，经叔丁醇梯度脱水之后，包埋在石蜡中，在轮转切片机上进行切片，然后将切片放在干净的载玻片上，加去离子水浮片，之后放在烘箱中进行烘片；(4)样品烘片后，在二甲苯中去蜡，然后经梯度乙醇复水后，在海氏苏木精染液中染色；(5)再经梯度乙醇脱水后，经1％固绿复染，经二甲苯透明之后用加拿大树胶封片观察，使用显微镜来统计正常花粉的百分率。优选的，所述步骤S3中步骤1处取多组样品，分别在处理之后的第2天、4天、6天及8天取样。优选的，所述轮转切片机对样品进行切片，切片厚度为8-10μM。优选的，所述观察和统计花粉百分率时，在OLYMPUSBX41光学显微镜下观察，并用OLYMPUSC-7070WideZooM拍照，照片用AdobePhotoshopCS5软件进行处理编辑。优选的，所述样品烘干的温度为43℃，同时需要进行24h的烘干过程。优选的，所述步骤S3中步骤5统计正常花粉百分率时，经苏木精和固绿染色后，在显微镜下观察花粉，会很清楚的观察到有的花粉空瘪、透明、畸形为异常的花粉，有的花粉饱满、规则、不透光为正常花粉，以此统计正常花粉的百分率可初步判断花粉的质量，正常花粉的百分率越高的花粉其质量相对越高。(三)有益效果本专利技术的有益效果在于：ABA的处理发现，过多的ABA亦会导致花粉成熟异常，不同浓度的ABA溶液处理花药表现出相似的结果，本文中所用到的10μM、100μM和1000μM的ABA溶液在处理后的第2天皆出现大量畸形花粉粒，此后随着处理时间的延长影响程度加剧，但总体保持相似的趋势。这说明，在番茄花粉的成熟过程中并非ABA浓度越高越好，当超过某一阈值时就会对番茄花粉的发育起到抑制的作用，而本文中10μM的ABA溶液也远远超过了花粉发育所需的阈值，对花粉发育所需ABA阈值的摸索有待后期进一步研究，而采用超过阈值浓度的ABA处理花药即可有效地引起花粉败育。本文分别以不同浓度的ABA及NDGA溶液处理番茄花药，以探索引起花粉败育的有效药剂浓度，研究结果将为进一步阐明ABA调控植物雄蕊发育的分子机制、揭示雄性不育的调控机理同时也为ABA相关的雄性不育在育种工作中的应用提供一定的理论基础。附图说明图1为番茄花器官发育期示意图；图2为NDGA处理番茄花药的显微观察示意图；图3为ABA处理番茄花药的显微观察示意图；图4为不同处理条件下正常花粉的百分率示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。如图1-4所示，本专利技术提供一种技术方案：一种外源ABA处理对番茄花粉成熟的细胞学影响的探究方法，包括以下步骤：S1、样本准备：番茄澳粉208自交系为实验样本；S2、试剂准备：脱落酸(ABA)：a,0μM浓度的ABA；b,10μM浓度的ABA；c,100μM浓度的ABA；d,1000μM浓度的ABA；甲二氢愈创木酸(NDGA)：e,0μM浓度的NDGA；f,10μM浓度的NDGA；g,100μM浓度的NDGA；h,1000μM浓度的NDGA；将以上试剂分别放入备用器皿中，方便后续使用；S3、试剂使用后对正常花粉的百分率检测(1)选取小孢子时期的花蕾，使用注射器取药液用针头轻轻掰开萼片，将药液注入花药处；取多组样品，分别在处理之后的第2天、4天、6天及8天取样；(2)将花蕾立即放入FAA固定液，真空抽气20-30Min，固定24h后进行石蜡切片制作；(3)经FAA固定液固定的样品，经叔丁醇梯度脱水之后，包埋在石蜡中，在轮转切片机上进行切片，然后将切片放在干净的载玻片上，加去离子水浮片，之后放在烘箱中进行烘片；轮转切片机对样品进行切片，切片厚度为8-10μM；(4)样品烘片后，在二甲苯中去蜡，然后经梯度乙醇复水后，在海氏苏木精染液中染色；样品烘干的温度为43℃，同时需要进行24h的烘干过程，经苏木精和固绿染色后，在显微镜下观察花粉，会很清楚的观察到有的花粉空瘪、透明、畸形为异常的花粉，有的花粉饱满、规则、不透光为正常花粉，以此统计正常花粉的百分率可初步判断花粉的质量，正常花粉的百分率越高的花粉其质量相对越高；(5)再经梯度乙醇脱水后，经1％固绿复染，经二甲苯透明之后用加拿大树胶封片观察，使用显微镜来统计正常花粉的百分率。所述观察和统计花粉百分率时，在OLYMPUSBX41光学显微镜下观察，并用OLYMPUSC-7070WideZooM拍照，照片用AdobePhotoshopCS5软件进行处理编辑。实验分析：图1中A为各个发育期花药的显微结构；B为9个发育期的花蕾实物图。其中Ⅰ为造孢细胞时期，花蕾长4mm；Ⅱ为小孢子母细胞时期，花蕾长6mm；Ⅲ为四分体时期，花蕾长8mm；Ⅳ为小孢子时期，花蕾长10mm；Ⅴ为初级本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外源ABA处理对番茄花粉成熟的细胞学影响的探究方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、样本准备：番茄澳粉208自交系为实验样本；S2、试剂准备：脱落酸(ABA)：a,0μM浓度的ABA；b,10μM浓度的ABA；c,100μM浓度的ABA；d,1000μM浓度的ABA；甲二氢愈创木酸(NDGA)：e,0μM浓度的NDGA；f,10μM浓度的NDGA；g,100μM浓度的NDGA；h,1000μM浓度的NDGA；将以上试剂分别放入备用器皿中，方便后续使用；S3、试剂使用后对正常花粉的百分率检测(1)选取小孢子时期的花蕾，使用注射器取药液用针头轻轻掰开萼片，将药液注入花药处；(2)将花蕾立即放入FAA固定液，真空抽气20‑30Min，固定24h后进行石蜡切片制作；(3)经FAA固定液固定的样品，经叔丁醇梯度脱水之后，包埋在石蜡中，在轮转切片机上进行切片，然后将切片放在干净的载玻片上，加去离子水浮片，之后放在烘箱中进行烘片；(4)样品烘片后，在二甲苯中去蜡，然后经梯度乙醇复水后，在海氏苏木精染液中染色；(5)再经梯度乙醇脱水后，经1％固绿复染，经二甲苯透明之后用加拿大树胶封片观察，使用显微镜来统计正常花粉的百分率。...

【技术特征摘要】
1.一种外源ABA处理对番茄花粉成熟的细胞学影响的探究方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、样本准备：番茄澳粉208自交系为实验样本；S2、试剂准备：脱落酸(ABA)：a,0μM浓度的ABA；b,10μM浓度的ABA；c,100μM浓度的ABA；d,1000μM浓度的ABA；甲二氢愈创木酸(NDGA)：e,0μM浓度的NDGA；f,10μM浓度的NDGA；g,100μM浓度的NDGA；h,1000μM浓度的NDGA；将以上试剂分别放入备用器皿中，方便后续使用；S3、试剂使用后对正常花粉的百分率检测(1)选取小孢子时期的花蕾，使用注射器取药液用针头轻轻掰开萼片，将药液注入花药处；(2)将花蕾立即放入FAA固定液，真空抽气20-30Min，固定24h后进行石蜡切片制作；(3)经FAA固定液固定的样品，经叔丁醇梯度脱水之后，包埋在石蜡中，在轮转切片机上进行切片，然后将切片放在干净的载玻片上，加去离子水浮片，之后放在烘箱中进行烘片；(4)样品烘片后，在二甲苯中去蜡，然后经梯度乙醇复水后，在海氏苏木精染液中染色；(5)再经梯度乙醇脱水后，经1％固绿复染，经二甲苯透明之后用加拿大树胶封片观察，使用显微镜来统计正常花粉的百分率。2.根据权利要求1所述的一种外源...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴圣杰，李静，季淑婷，陈林凤，解思瑾，庄新研，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：山东,37