【技术实现步骤摘要】
基因敲除选育adgrf3b基因缺失型斑马鱼的方法
本专利技术涉及基因敲除领域,尤其涉及基因敲除选育adgrf3b基因缺失型斑马鱼的方法。
技术介绍
adgrf3b基因位于斑马鱼第20号染色体上,包含14个外显子和13个内含子,cDNA全长5421bp,编码1016氨基酸,发现adgrf3b在人类胚胎早期的多个组织中都有表达,特别是肠道中强烈表达。斑马鱼与人类肠道发育过程中的基因、信号通路有高度同源性,且adgrf3b基因进化上较为保守,研究发现adgrf3b在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且,与其他动物模型相比,斑马鱼具有个体小、易于饲养、发育快、繁殖能力强、体外受精、胚胎体外发育且透明等优点。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,在斑马鱼的adgrf3b基因上设计合适的打靶位点,在体外合成的特异性sgRNA(终浓度20ng/μL)和Cas9-mRNA(终浓度150ng/μL),显微共注射进入斑马鱼一细胞内,胚胎培养60h后,通过选取胚胎进行基因型分析,鉴定所设打靶位点的有效性。基因打靶技术起源于20世纪80年代末,是一种通过对基因组进行定点修饰来研究基因功能的重要方法手段,也可用于治疗人类的各种遗传性疾病。该技术主要是利用缺失突变、基因灭活、染色体大片段删除以及外源基因导入等方式来改变生物的遗传信息,并且在生殖系中稳定遗传后表达突变性状,从而研究生物体内特定基因在生长发育过程中的作用,所以这类技术手段已成为现代分子生物学研究热点。传统的基因打靶技术是建立在胚胎干细胞(ESC)和同源重组技术的基础之上,故打靶技术效率极低。一种全新的人工核酸内切酶clus ...
【技术保护点】
1.基因敲除选育adgrf3b基因缺失型斑马鱼的方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤一:CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计和PCR检测引物在NCBI数据库上查询斑马鱼adgrf3b基因的基因组DNA序列,在SMART网站上分析功能结构域,在The ZiFiT Targeter网站上设计斑马鱼adgrf3b基因的靶位点,位于基因组的第十号外显子上;两对特异性靶位点PCR引物如下:F1(靶位点a正向引物):GCGTAATACGACTCACTATAGGAACGTCTCAGAAGAGAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGF2(靶位点b正向引物):GCGTAATACGACTCACTATAGGGCATGCTTATTGGGTACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGR(共用的反向引物):AAGCACCGACTCGGTGCCACTPCR检测引物PCR检测引物上下游引物分别位于adgrf3b第十号外显子上:F(5’‑GTATCCAGCACAGTTGAGAAC‑3’)R(5’‑GACCAGACCAAGAACTCAATG‑3;通用模板序列为:TTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAA ...
【技术特征摘要】
1.基因敲除选育adgrf3b基因缺失型斑马鱼的方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤一:CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计和PCR检测引物在NCBI数据库上查询斑马鱼adgrf3b基因的基因组DNA序列,在SMART网站上分析功能结构域,在TheZiFiTTargeter网站上设计斑马鱼adgrf3b基因的靶位点,位于基因组的第十号外显子上;两对特异性靶位点PCR引物如下:F1(靶位点a正向引物):GCGTAATACGACTCACTATAGGAACGTCTCAGAAGAGAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGF2(靶位点b正向引物):GCGTAATACGACTCACTATAGGGCATGCTTATTGGGTACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGR(共用的反向引物):AAGCACCGACTCGGTGCCACTPCR检测引物PCR检测引物上下游引物分别位于adgrf3b第十号外显子上:F(5’-GTATCCAGCACAGTTGAGAAC-3’)R(5’-GACCAGACCAAGAACTCAATG-3;通用模板序列为:TTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTT步骤二:PCR产物进行基因特异性gRNA体外合成2.1)以合成的DNA为模板,通过特异性引物进行PCR,扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA;正向特异性靶位点引物F1或F2:T7启动子20pb靶序列20bpgRNA上游骨架,反向引物R:20bpgRNA下游骨架,PCR反应体系如下:震荡均匀之后,4℃离心,于PCR仪上进行扩增反应;2.2)检测确定条带正确之后,进行琼脂糖凝胶DNA回收,纯化回收PCR产物;2.3)测定纯化的DNA浓度,再以此DNA为模板,用20μL体系进行体外转录,合成特异性gRNA,体系如下:体外转录反应体系:将反应物全部加入0.2mLEP管中,混匀之后,于37℃水浴2h;水浴结束后,消化DNA模板,然后电泳;2.4)特异性gRNA的纯化用RNeasyMinikit试剂盒纯化转录成功的gRNA,保存于-20℃;进行琼脂糖凝胶电泳,以检验纯化产物,并用Nanodrop测定纯化之后的gRNA浓度;步骤三:斑马鱼胚胎的显微注射在受精后30min之内,用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中,在进行显微注射之前,将Cas9mRNA和gRNA配成混合液,充分混匀,使Cas9mRNA的终浓度为150ng/μL,gRNA的终浓度为20ng/μL,注射约1.0nLCas9mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内;注射过的受精卵放置于E3水中,28.5℃孵化;在体式显微镜下观察胚胎表型,筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析;显微注射体系如下:步骤四:Sanger测序检测靶位点的有效性对斑马鱼胚胎进行显微注射之后,挑选部分发育正常的早期胚胎,检测其adgrf3b基因是否存在突变;4.1)提取斑马鱼基因组斑马鱼胚胎受精36小时后(36hpf),分别收集野生型和注射后胚胎于1.5mLEp管中,每管2颗胚胎,按照下述方法提取基因组DNA,具体步骤如下:向装有胚胎的Ep管中加入200μL细胞裂解液,2μL蛋白酶K,放置于55℃水浴锅中裂解过夜;裂解完成后,放在震荡器上充分震荡,加入等体积预先冷却的异丙醇于Ep管中,充分颠倒混匀,于4℃条件下,12000×g离心10min,倒掉上清液;加入75%乙醇500μL,于4℃条件下,12000×g离心5min,弃上清液,室温风干20min;加入60μL去离子水,充分吹打混匀,琼脂糖凝胶电泳检测提取效率;4.2)PCR扩增目的序列提取基因组DNA后,根据CRISPR靶位点上下游约150-200bp的基因组区域,利用PrimerPr...
【专利技术属性】
技术研发人员:谢华平,付贵芳,谢缤灵,曾婷,王飞英,印遇龙,
申请(专利权)人:湖南师范大学,
类型:发明
国别省市:湖南,43
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