重组藏猪IFN-λ3成熟肽的克隆及表达方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种重组藏猪IFN‑λ3成熟肽的克隆及表达方法和应用，通过提取IFN‑λ3总RNA，进行PCR扩增，将产物转化至感受态细胞中培养，以获得的质粒进行PCR扩增，产物转化感受态细胞中培养。通过将pMD19‑T‑mZPoIFN‑λ3双酶切并与pET‑32a(+)连接，进行转化培养，得到其表达载体。本发明专利技术重组藏猪IFN‑λ3成熟肽经试验证明，对PoRV具有较高的抗病毒效应，可应用于制备抗猪轮状病毒活性药物。

Cloning, expression and application of recombinant IFN- 3 lambda mature peptide from Tibetan pigs

【技术实现步骤摘要】
重组藏猪IFN-λ3成熟肽的克隆及表达方法和应用
本专利技术属于生物工程
，涉及一种重组藏猪IFN-λ3成熟肽的克隆及表达方法和应用，具体为重组藏猪IFN-λ3成熟肽的基因克隆，及其表达、纯化、包涵体复性方法。
技术介绍
干扰素是一种功能多样的糖蛋白。目前，根据干扰素的来源、核苷酸和氨基酸序列、结构、受体以及生物学功能的不同，将其分为Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)、Ⅱ型干扰素(IFN-γ)以及Ⅲ型干扰素(IFN-λ)。一直以来，由于III型干扰素具有与I型干扰素相似的生物学功能和信号通路重叠而未被受到重视，随后的研究发现，与I型干扰素受体在机体内广泛分布不同的是，III型干扰受体特异性广泛分布在上皮组织和器官中，这意味这III型干扰在上皮组织和器官中的作用比I型干扰素更加特异，而且III型干扰受体在造血系统和神经系统分布较少，在临床应用中可能不会产生相关的副作用。I型干扰素本身也有缺点，其在体内的活性不稳定，半衰期短。基于此，III型干扰素有望成为I型干扰素的替代品应用于各种临床疾病的治疗，然而相较于对人的IFN-λ研究，对猪IFN-λ的研究起步较晚，仅发现IFN-λ1和IFN-λ3两个亚型。在对III型干扰素各成员的抗病毒活性研究中发现，IFN-λ3的抗病毒活性显著强于IFN-λ1。由于常年受腹泻的影响，我国养猪业受到了巨大的经济损失，而轮状病毒便是导致婴幼儿和多种幼龄动物病毒学腹泻的主要病原的之一，猪轮状病毒是轮状病毒的成员，常造成猪场仔猪高发病率和死亡率，临床症状主要为腹泻、呕吐和脱水等，且猪轮状病毒常与其他能够引起腹泻的病毒以及细菌混合感染，导致猪场疫情加重，成年猪常隐性感染，不断向外排毒，导致疫情反复，给世界养猪业造成巨大经济损失。目前我国虽广泛接种各种猪病疫苗，仍不能有效控制该病的流行。IFN-λ3成熟肽能有效的增加猪仔的免疫功能，提高机体对病毒防御作用，且拥有无残留与无副作用等特点，深受临床兽医和养殖户的喜爱。奈何IFN-λ3的生物效应具有高度的种属特异性，且天然的IFN-λ3在机体内表达甚微，尤其是藏猪体内，难以直接从体内大量表达提取供临床研究与应用。因此，本专利技术通过基因工程手段提供了一种成本低廉且可大量表达重组藏猪IFN-λ3成熟肽的方法。近年来，基因工程研究发展迅猛。许多异源蛋白已经被成功的表达，并且已经被投入生产应用当中。pET系统是被大量研究的表达系统，在许多研究中都有举足轻重的地位，拥有很高的诱导效率，其目标蛋白产物能够在几小时就达到极高的水平。藏猪是一类我国特有的特种经济动物。其特点表现为适应恶劣环境程度高、抗病力强及耐粗等特点。因此，本专利技术通过基因工程手段提供了一种成本低廉且可大量表达重组藏猪IFN-λ3成熟肽表达系统和方法。同时，鉴于原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，产物以生物活性较低的包涵体的形式产生，本专利技术提供包涵体纯化与复性技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术不足之地，提供一种可在大肠杆菌内高效表达重组藏猪IFN-λ3成熟肽的基因克隆，及其表达、纯化、包涵体复性方法。为了实现上述技术目的，本专利技术具体通过以下技术方案实现：一种藏猪IFN-λ3成熟肽的克隆方法，具体包括以下步骤：1)以从藏猪肺脏与肠道中提取的IFN-λ3总RNA为模板，P1、P2为引物，反转录后进行PCR扩增；上游引物P1:atggccctgggtggct；下游引物P2:tcagacacacaggtctccac；2)对扩增的藏猪IFN-λ3基因进行纯化，与载体pMD19-T16℃连接过夜，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中培养，获得的菌液抽提质粒命名为pMD19-T-ZPoIFN-λ3；3)以上述的pMD19-T-ZPoIFN-λ3的质粒为模板，P3和P4为上下游引物，进行PCR扩增，将产物纯化后转化至DH5α感受态细胞中培养。上游引物P3:cgcggatccgtgcctgtccctgaagccc；下游引物P4:cccaagctttcagacacacaggtctccac。在本专利技术的另一方面，本专利技术还提供了用以扩增IFN-λ3全长基因的引物，所述的引物为P1和P2。在本专利技术的另一方面，本专利技术还提供了用以扩增IFN-λ3成熟肽基因的引物，所述的引物为P3和P4。在本专利技术的另一方面，本专利技术还提供了包含了上述所述编码重组藏猪IFN-λ3基因的载体，所述的载体为原核表达，优选为pET-32a(+)。在本专利技术的另一方面，重组藏猪IFN-λ3成熟肽在大肠杆菌中的表达方法，利用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pMD19-T-mZPoIFN-λ3得到mZPoIFN-λ3片段，与pET-32a(+)连接后转入大肠杆菌培养得到表达质粒pET-32a-mZPoIFN-λ3；将质粒pET-32a-mZPoIFN-λ3转化表达菌株BL21(DE3)感受态细胞中培养，离心处理收集菌体沉淀。在本专利技术的另一方面，本专利技术还提供了重组藏猪IFN-λ3成熟肽包涵体的纯化方法，包括：洗涤上述收集到的菌体沉淀，纯化得到包涵体。在本专利技术的另一方面，本专利技术还提供了重组藏猪IFN-λ3成熟肽包涵体复性与浓缩方法，包括：将包涵体置于处理后的透析袋中进行进行缓慢透析，逐渐降低尿素浓度，最后置于无尿素的缓冲液透析，随后取适量的PEG-20000置于平皿中，将透析袋放入其中进行浓缩。在本专利技术的另一方面，重组藏猪IFN-λ3成熟肽在制备抗猪轮状病毒活性药物中的用途。通过重组藏猪IFN-λ3成熟肽体外对PoRV的抗病毒活性实验，得出重组藏猪IFN-λ3成熟肽对PoRV具有较高的抗病毒效应，且抗病毒活性呈现剂量与时间的依赖。本专利技术的有益效果为：本专利技术通过基因工程手段提供了一种成本低廉且可大量表达重组藏猪IFN-λ3成熟肽表达系统和方法。同时，鉴于原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，产物以生物活性较低的包涵体的形式产生，本专利技术提供包涵体纯化与复性技术。附图说明图1是藏猪IFN-λ3的PCR扩增电泳图；1：PCR产物，2：阴性对照M:DNAMarker；图2是pMD19-T-ZPoIFN-λ3的PCR鉴定；M：DNAMarker，1-5：PCR产物，6：阴性对照；图3是藏猪IFN-λ3成熟蛋白基因的PCR扩增；M：DNAMarker；1：阴性对照；2：PCR产物；图4是pMD19-T-mZPoIFN-λ3的PCR鉴定；M：DNAMrker，1-5:PCR产物，6：阴性对照；图5是重组质粒pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3的酶切鉴定；M：DNAMrker，1:BamHⅠ和HindⅢ双酶切pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3产物，2：pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3；图6是重组质粒pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3表达产物SDS-PAGE分析；M：标准蛋白质分子，1：未诱导表达pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3/BL21(DE3)产物，2:诱导表达pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3/BL21(DE3)产物；图7是诱导时间对重组蛋白表达影响；M：标准蛋白质分子，1-5：诱导时间为1、2、3、4、5h；图8是IPTG浓度对重组蛋白表达影响；M：标准蛋白质分子，1-5：PTG浓度分别为0.2、0.4、0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种藏猪IFN‑λ3成熟肽的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以从藏猪肺脏与肠道中提取的IFN‑λ3总RNA为模板，P1、P2为引物，反转录后进行PCR扩增；上游引物P1:5’‑ATGGCCCTGGGTGGCT‑3’；下游引物P2:5’‑TCAGACACACAGGTCTCCAC‑3’；2)对扩增的藏猪IFN‑λ3基因进行纯化，与载体pMD19‑T16℃连接过夜，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中培养，获得的菌液抽提质粒命名为pMD19‑T‑ZPoIFN‑λ3；3)以上述的pMD19‑T‑ZPoIFN‑λ3的质粒为模板，P3和P4为上下游引物，进行PCR扩增，将产物纯化后转化至DH5α感受态细胞中培养。上游引物P3:5’‑CGCGGATCCGTGCCTGTCCCTGAAGCCC‑3’；下游引物P4:5’‑CCCAAGCTTTCAGACACACAGGTCTCCAC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种藏猪IFN-λ3成熟肽的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以从藏猪肺脏与肠道中提取的IFN-λ3总RNA为模板，P1、P2为引物，反转录后进行PCR扩增；上游引物P1:5’-ATGGCCCTGGGTGGCT-3’；下游引物P2:5’-TCAGACACACAGGTCTCCAC-3’；2)对扩增的藏猪IFN-λ3基因进行纯化，与载体pMD19-T16℃连接过夜，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中培养，获得的菌液抽提质粒命名为pMD19-T-ZPoIFN-λ3；3)以上述的pMD19-T-ZPoIFN-λ3的质粒为模板，P3和P4为上下游引物，进行PCR扩增，将产物纯化后转化至DH5α感受态细胞中培养。上游引物P3:5’-CGCGGATCCGTGCCTGTCCCTGAAGCCC-3’；下游引物P4:5’-CCCAAGCTTTCAGACACACAGGTCTCCAC-3’。2.一种用以扩增IFN-λ3全长基因的引物，其特征在于，所述的引物为P1和P2。3.一种用以扩增IFN-λ3成熟肽基因的引...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷玥，朱玲，冯宇，徐志文，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51