本发明专利技术公开一种杜仲提取物中7个入血成分的浓度测定方法，首先用京尼平苷酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇单葡萄糖苷配制标准对照液；用葛根素配置内标溶液；然后采用HPLC‑ESI‑MS/MS分析方法，建立同时测定大鼠血浆中杜仲提取物中7个成分的浓度的分析方法；结果表明，本发明专利技术的测定方法具有线性范围广、灵敏度高、定量限低的优点，能够准确可靠的同时测定给自发性高血压大鼠灌胃给予杜仲提取物后的15个不同时间点所得大鼠血浆中杜仲提取物中的7个成分的浓度，可以为研究杜仲提取物中7个成分的药代动力学特征提供技术支撑。
A Method for Determining the Concentration of Seven Ingredients in Eucommia ulmoides Oliv Extract
【技术实现步骤摘要】
一种杜仲提取物中7个入血成分的浓度测定方法
本专利技术涉及一种杜仲提取物中7个入血成分的浓度测定方法，属于中药学研究
技术介绍
杜仲(Eucommiaulmoides)，又名思仙、思仲、木棉，是我国特有的药用植物，是国家二类珍稀保护植物，主要分布于甘、陕、豫、鄂、晋、湘、川、滇、黔、杜、闽等省，其皮、茎、叶均可入药，其传统药理作用为“补肝肾、强筋骨、降血压等”。现代医学研究表明，杜仲具有降血压、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、抗HIV活性、抗骨质疏松、抗菌消炎、抑制骨细胞增殖、镇静止痛、保肝利胆、利尿等功效。研究发现杜仲中的成分，主要有苯丙素类、环烯醚萜类、木脂素类、黄酮、多糖、氨基酸、杜仲胶等有机化合物及铁、钙等无机微量元素。随着中药的国际化进程的不断推进以及广大国民对药物治疗的多元化的需求不断增加，中药越来越得到广大患者的认可，中药已成为广大患者的用药选择之一。但由于一方面中药含有的化学成分较多，而且有些成分不清楚；另一方面，服用中药后，其有效成分在体内的暴露量较低，使得能够表征中药整体的药代动力学研究非常困难。因此，建立灵敏准确的测定中药入血成分的方法对于研究中药的药代动力学至关重要。尽管对于杜仲的化学、药理和临床应用已有不少报道，但是，关于杜仲的药代动力学的研究基础较为薄弱，关于杜仲的药代动力学的研究明显不足，严重限制了对杜仲药用资源的深度开发和临床上的广泛应用。众所周知，建立快速、准确的体内生物样品中微量药物定量的分析方法是药代动力学研究的必备条件。目前关于杜仲入血成分的研究，或者灵敏度过低、或者检测成分少，无法满足表征杜仲整体药代动力学的要求。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种杜仲提取物中7个入血成分的浓度测定方法，该方法以京尼平苷酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷为检测指标，以葛根素为内标，建立一种采用高液相色谱-电喷雾-串联质谱HPLC-ESI-MS/MS同时测定大鼠血浆中杜仲提取物中7个成分的分析方法，为进一步研究杜仲提取物中7个成分的药代动力学特征提供技术支撑。本专利技术是这样构成的：一种杜仲提取物中7个入血成分的浓度测定方法，包括以下步骤：步骤(1)：用京尼平苷酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇单葡萄糖苷配制7个成分的标准对照液；用葛根素配制内标溶液，建立血浆样品的处理方法，并采用高液相色谱-电喷雾-串联质谱HPLC-ESI-MS/MS联用仪对7个成分的色谱条件和质谱条件进行优化，确定7个成分优化的色谱条件如下：色谱柱：WatersBEHC18，2.1mm×100mm，1.7μm，保护柱：WatersVanGuardBEHC18，2.1mm×5mm，1.7μm，流速：0.30mL·min-1，柱温：40℃，流动相：0.1％甲酸水A，0.1％甲酸乙腈B，梯度洗脱，进样体积为1μL，并且确定7个成分优化的质谱条件；步骤(2)：建立同时测定杜仲提取物中7个入血成分的浓度的HPLC-ESI-MS/MS方法，并对该方法进行验证，包括专属性考察、标准曲线的制备、准确度和精密度、提取回收率、基质效应以及稳定性考察；最后，将上述方法用于测定模型大鼠以一定剂量灌胃杜仲提取物后15个不同时间点所得血浆中的7个入血成分的浓度。上述方法中，步骤(1)所述优化的梯度洗脱，具体洗脱梯度如下：0～0.5min，90％～90％(A)；0.5～7.5min，90％～75％(A)；7～8min，75％～65％(A)；8～9min，65％～10％(A)；9～9.5min，10％～10％(A)；9.5～10.5min，10％～90％(A)；10.5～13min，90％～90％(A)。上述方法中，步骤(1)所述优化的质谱条件，具体如下：采用电喷雾电离源(ESI)，离子化电压(IS)：4500V，离子源温度(TEM)：550℃，气帘气(CUR，N2)：40psi，喷撞气(CAD，N2)：Medium，喷雾气(GS1，N2)：55psi，辅助加热气(GS2，N2)：55psi，扫描方式为多反应离子监测(MRM)；离子对如下：京尼平苷酸m/z373.20→123.00、原儿茶酸m/z152.90→109.10、新绿原酸m/z353.17→191.04、绿原酸m/z353.19→191.03、隐绿原酸m/z353.21→173.10、松脂醇二葡萄糖苷m/z681.00→357.20、松脂醇单葡萄糖苷m/z519.2→357.20、葛根素(内标)417.10→267.10；DP电压分别为：-40v、-60v、-51v、-70v、-80v、-70v、-76v、110v；EP电压分别为：-6v、-6v、-7v、-7v、-5v、-4v、-8v、7v；CE电压分别为：-26v、-21v、-19v、-24v、-21v、-35v、-25v、35v；CXP电压分别为：-6v、-9v、-8v、-7v、-10v、-23v、-31v、6v。上述方法中，步骤(2)所述的模型大鼠是指自发性高血压大鼠。上述方法中，步骤(2)所述的一定剂量是指5～10g/kg。由于采用了上述技术方案，本专利技术的优点在于：本专利技术以京尼平苷酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷为检测指标，以葛根素为内标，建立一种采用高液相色谱-电喷雾-串联质谱HPLC-ESI-MS/MS同时测定大鼠血浆中杜仲提取物中7个成分的分析方法，该方法具有线性范围广、灵敏度高，定量限低的优点，能够准确可靠的同时测定给自发性高血压大鼠灌胃给予杜仲提取物后的15个不同时间点所得大鼠血浆中杜仲提取物中的7个成分的浓度，可以为研究杜仲提取物中7个成分的药代动力学特征提供技术支撑。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细说明。本专利技术的实施例：1.仪器与材料1.1仪器API5500Q-TRAP型高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪(AB-SCIEX系统，AnalystSoftware工作站)，MRBP无创血压计(美国IITC公司)，VX-Ⅲ多管涡旋振荡器(北京藤锦医药科技有限公司)，Allegra64R低温高速离心机(美国BeckmanCoulter公司)，KQ-300DE超声波清洗机(贵州中润四通科技有限公司)，NA-5L氮空一体机(北京中兴汇利科技发展有限公司)，WP-UP-II-20分析型超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)，EL204万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。1.2材料松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷酸、绿原酸、原儿茶酸、葛根素对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为111537-201204，111828-201403，110753-201415，110809-201205，110752-201514，纯度分别为≥90.9％，≥94.6％，≥96.2％，≥99.9％，≥95.5％)，新绿原酸、隐绿原酸对照品(四川维克奇生物科技有限公司，批号分别为160318，160304，纯度均≥98％)，松脂醇单葡萄糖苷对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号P09J7F8760，纯度≥98％)；甲醇(天津市科密欧本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种杜仲提取物中7个入血成分的浓度测定方法，其特征在于包括以下步骤：步骤(1)：用京尼平苷酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇单葡萄糖苷配制7个成分的标准对照液，用葛根素配制内标溶液，然后建立血浆样品的处理方法，并采用高液相色谱‑电喷雾‑串联质谱HPLC‑ESI‑MS/MS联用仪对7个成分的色谱条件和质谱条件进行优化，确定7个成分优化的色谱条件如下：色谱柱：Waters BEH C18，2.1mm×100mm，1.7μm，保护柱：Waters Van Guard BEH C18，2.1mm×5mm，1.7μm，流速：0.30mL·min
【技术特征摘要】
1.一种杜仲提取物中7个入血成分的浓度测定方法，其特征在于包括以下步骤：步骤(1)：用京尼平苷酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇单葡萄糖苷配制7个成分的标准对照液，用葛根素配制内标溶液，然后建立血浆样品的处理方法，并采用高液相色谱-电喷雾-串联质谱HPLC-ESI-MS/MS联用仪对7个成分的色谱条件和质谱条件进行优化，确定7个成分优化的色谱条件如下：色谱柱：WatersBEHC18，2.1mm×100mm，1.7μm，保护柱：WatersVanGuardBEHC18，2.1mm×5mm，1.7μm，流速：0.30mL·min-1，柱温：40℃，流动相：0.1％甲酸水A，0.1％甲酸乙腈B，梯度洗脱，进样体积为1μL，并且确定7个成分优化的质谱条件；步骤(2)：建立同时测定杜仲提取物中7个入血成分的浓度的HPLC-ESI-MS/MS方法，并对该方法进行验证，包括专属性考察、标准曲线的制备、准确度和精密度、提取回收率、基质效应以及稳定性考察；最后，将上述方法用于测定模型大鼠以一定剂量灌胃杜仲提取物后15个不同时间点所得血浆中的7个入血成分的浓度。2.根据权利要求1所述的杜仲提取物中7个入血成分的浓度测定方法，其特征在于：步骤(1)所述优化的梯度洗脱，具体洗脱梯度如下：0～0.5min，90％～90％(A)；0.5～7.5min，90％～75％(A)；7～8min，75％～65％(A)；8～9min，65％～10％(A)；9～9.5min，10％～10％(A)；9.5～10.5min，10％～90％(A)；10.5～13min...
【专利技术属性】
技术研发人员：巩仔鹏，张楠，吴林霖，李月婷，王广成，李梅，胡贺佳，肖红琴，陈思颖，郑林，王爱民，黄勇，王永林，刘丽娜，
申请(专利权)人：贵州医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52
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