【技术实现步骤摘要】
一种固定化酶催化生产左旋多巴的方法与应用
本专利技术涉及一种固定化酪氨酸酚裂解酶及转化方法与应用，属于酶催化领域。
技术介绍
左旋多巴(3,4-dihydroxyphenyl-L-ananine，简称L-DOPA)的化学名称为3,4-二羟基苯基丙氨酸，其结构式为：作为一种重要的生物活性物质，L-DOPA是从L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物。上世纪60年代，国外许多学者开始致力于微生物酶法合成L-DOPA的研究。为了提高L-DOPA产量和底物转化率，研究者们对微生物酶法合成L-DOPA的工艺方法进行了大量研究。酪氨酸酚裂解酶(Tyrosinephenollyase，TPL，E.C.4.1.99.2)，又名β-酪氨酸酶，该酶分子量约200kDa，是一个四聚体酶。TPL酶以磷酸吡哆醛(pyridoxal-phosphate，PLP)为辅酶，以钾离子和氨离子为辅助因子，TPL可以催化L-酪氨酸发生β-消去反应生成苯酚、丙酮酸和氨。由于这个反应是可逆的，将邻苯二酚代替苯酚后，可由邻苯二酚、丙酮酸和氨可在TPL催化下生成L-DOPA。左旋多巴的前体...
【技术保护点】
1.一种固定化酶催化生产左旋多巴的方法，其特征在于：(1)挑单菌落接种到含LB培养基的试管中，加氨苄青霉素(100mg/L)30‑37℃，220rpm，培养12‑16h，得到一级种子；(2)将所述一级种子接种到含发酵培养基的摇瓶中，30‑37℃，200‑250rpm，培养2‑5h，加IPTG至终浓度0.6mM，28‑32℃，180‑220rpm，培养10‑12h；所述发酵培养基组分如下：胰蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、甘油5g/L，磷酸二氢钾2.31g/L、三水磷酸氢二钾16.43g/L；(3)离心收菌，得到菌体，压榨破胞，加壳聚糖溶液絮凝，高速离心，获得上清酶液...
【技术特征摘要】
1.一种固定化酶催化生产左旋多巴的方法，其特征在于：(1)挑单菌落接种到含LB培养基的试管中，加氨苄青霉素(100mg/L)30-37℃，220rpm，培养12-16h，得到一级种子；(2)将所述一级种子接种到含发酵培养基的摇瓶中，30-37℃，200-250rpm，培养2-5h，加IPTG至终浓度0.6mM，28-32℃，180-220rpm，培养10-12h；所述发酵培养基组分如下：胰蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、甘油5g/L，磷酸二氢钾2.31g/L、三水磷酸氢二钾16.43g/L；(3)离心收菌，得到菌体，压榨破胞，加壳聚糖溶液絮凝，高速离心，获得上清酶液，加入固定化载体EP200，25℃搅拌混合12-24h，三足式离心收集固定化酶，用50mM的磷酸钾缓冲液(pH8.0)，多次洗涤，过滤，获得固定化酶；(4)固定化酶20g，加入底物溶液，搅匀，25℃，密封震荡反应；所述底物溶液包括14-16g/L的丙酮酸钠、10-12g/L的邻苯二酚、40-45g/L的氯化铵、2-5g/L的亚硫酸钠、1-3g/L的EDTA，调pH7.5-8.5。2.根据权利要求1所述的一种固定化酶催化生产左旋多巴的方法，其特征在于，所述的LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物0.5g/L、氯化钠10g/L、纯水。3.根据权利要求1所述的一种固定化酶催化生产左旋多巴的方法，其特征在于，所述的发酵培养基包括胰蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、甘油5g/L，磷酸二氢钾2.31g/L、三水磷酸氢二钾16.43g/L和纯水。4.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：储消和，吴黎诚，生英涛，陈万河，程跃，徐顺清，沈建，方明山，余炜，柳鹏福，孙俊杰，
申请(专利权)人：浙江工业大学，浙江绿创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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