一种新型腺病毒包装方法在CRISPR/Cas9基因编辑方法中的应用技术

本发明专利技术实施例涉及生物技术领域，具体涉及一种新型腺病毒包装方法在CRISPR/Cas9基因编辑方法中的应用。本发明专利技术提供的腺病毒包装方法采用在体外进行连接的方法得到重组载体，避免了传统pAdEasy系统使用电转法使pAdEasy和穿梭质粒在细菌内发生同源重组的步骤，步骤简单，成功率高，且节省了腺病毒包装的时间，包装效率高，省时高效。本发明专利技术针对CRISPR/Cas9技术，设计了可用于新型腺病毒包装方法的pBlue‑DsRed‑Cas9和pBlue‑EGFP‑sgRNA等载体。对不同基因进行编辑时，只需改变pBlue‑EGFP‑sgRNA载体中sgRNA序列，pBlue‑DsRed‑Cas9载体可作为通用载体用于不同基因的编辑。本发明专利技术提供的新型腺病毒包装方法包装得到的腺病毒，用于CRISPR/Cas9技术，基因编辑效率高。

Application of a New Adenovirus Packaging Method in CRISPR/Cas9 Gene Editing

【技术实现步骤摘要】
一种新型腺病毒包装方法在CRISPR/Cas9基因编辑方法中的应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种新型腺病毒包装方法在CRISPR/Cas9基因编辑方法中的应用。
技术介绍
重组腺病毒具有广泛的应用，例如作为载体其可以高效运输、表达目的基因。与其它类型的病毒相比，腺病毒具有以下特点。首先，腺病毒可以感染不同类型的细胞，无论细胞处于分裂期或静息期。其次，腺病毒感染细胞后，其基因组不会整合到宿主细胞，因此致癌风险较低。第三，腺病毒经过一系列改造后包装容量比较大，可包装达到7.5kb的外源基因。另外，腺病毒的扩增比较简单，且容易得到高滴度的病毒进而获得理想的外源基因的表达。最近的研究表明利用腺病毒作为载体，可以将CRISPR/Cas9系统表达于宿主细胞，对宿主细胞进行高效的基因编辑。常用的构建重组腺病毒的方法主要有两种，一种方法是直接将目的基因连接至腺病毒基因组，但因腺病毒基因组较大，可用的酶切位点较少，酶切位点选择受限制，限制了此方法的应用。另一种方法是将目的基因先克隆至中间质粒，然后利用细菌内的同源重组将中间质粒中外源基因整合到腺病毒基因组，此方法目前应用较为广泛，如AdEasy系统、AdMax系统等。AdEasy系统是目前重组腺病毒的最常用体系，其操作步骤主要为：首先将目的基因通过酶切连接方式连接到穿梭载体(pShuttle，卡那霉素抗性)中，转化到DH5α、Top10等感受态细胞中；卡那霉素抗性LB培养基生长，酶切鉴定，阳性质粒应用PmeⅠ线性化再电击转化BJ5183-AD-1细菌(携带有pAdEasy-1质粒)，在细菌内pAdEasy-1和穿梭质粒发生同源重组；高浓度卡那霉素抗性LB培养基过夜生长后，出现大克隆和小克隆；挑选小克隆，酶切鉴定为阳性的质粒再经过转化XL10-Gold细胞，提取质粒，PacⅠ酶切线性化；转染AD-293细胞系，再经1-2周包装出病毒。该系统避免了在体外构建过大DNA腺病毒质粒的过程，与之前技术相比节省了数周时间。然而利用细菌内的同源重组过程耗时较长，阳性克隆筛选效率低，构建腺病毒时需要消耗大量劳动。CRISPR/Cas9(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsassociatedprotein9)是一类新型基因编辑技术，相较于ZFN、TALEN等基因编辑技术具有编辑效率高、脱靶率低、设计简便等诸多优点。应用重组病毒为载体将Cas9和针对特定位点设计的sgRNA导入细胞内进行高效基因编辑具有重要意义。由于传统AdEasy系统包装腺病毒有上述缺陷，开发一种新型腺病毒包装体系在CRISPR/Cas9基因编辑技术中显得十分重要。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
专利技术目的为解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种新型腺病毒包装方法在CRISPR/Cas9基因编辑方法中的应用。本专利技术提供的腺病毒包装方法，采用在体外进行连接的方法得到重组载体，避免了传统pAdEasy系统使用电转法使pAdEasy和穿梭质粒在细菌内发生同源重组的步骤，步骤简单，成功率高，且节省了腺病毒包装的时间，腺病毒包装效率提高，省时高效。本专利技术使用的pAd-Blue载体是根据pAdEasy-1载体改造而成的新载体，pBlue载体(或pBlue载体的衍生载体)是根据pShuttle载体改造而成的新载体，二者可通过酶连接的方法连接到一起，操作简单，连接成功率高，可用于上述腺病毒包装方法。本专利技术针对CRISPR/Cas9技术，设计了可用于新型腺病毒包装方法的pBlue-DsRed-Cas9和pBlue-EGFP-sgRNA等载体。对不同基因进行编辑时，只需改变pBlue-EGFP-sgRNA载体中sgRNA序列，pBlue-DsRed-Cas9载体可作为通用载体用于不同基因的编辑；还可将Cas9和sgRNA构建到同一个pBlue载体(或其衍生载体上)，利用本专利技术提供的腺病毒包装方法将Cas9和sgRNA包装到同一个腺病毒中。本专利技术提供的新型腺病毒包装方法包装得到的腺病毒，用于CRISPR/Cas9技术，基因编辑效率高。解决方案为实现本专利技术目的，本专利技术实施例提供了一种pAd-Blue载体，该载体是根据pAdEasy-1载体改造而成的新载体，其包括pAdEasy-1载体序列，和依次位于pAdEasy-1载体的Pac1酶切位点和pBR322Ori位点之间的LacZ基因和Cla1酶切位点。Pac1酶切位点、LacZ基因、Cla1酶切位点和pBR322Ori位点之间还可分别包含0-数百个bp的连接序列。上述pAd-Blue载体在一种可能的实现方式中，所述pAd-Blue载体中，位于pAdEasy-1载体的Pac1酶切位点和pBR322Ori位点之间的序列包括SEQIDNO.1所示序列或其互补序列或其反向互补序列。本专利技术实施例还提供了一种pAd-Blue载体的构建方法，pAd-Blue载体通过改造pAdEasy-1载体得到，包括：在pAdEasy-1载体的Pac1酶切位点和pBR322Ori位点之间插入依次包含LacZ基因和Cla1酶切位点的序列。Pac1酶切位点、LacZ基因、Cla1酶切位点和pBR322Ori位点之间还可分别包含0-数百个bp的连接序列。上述pAd-Blue载体的构建方法在一种可能的实现方式中，包括：用Pac1和Cla1双酶切pAdEasy-1载体，取得到的pAdEasy-1大片段；获得包括LacZ基因、Cla1酶切位点、pBR322Ori位点和氨苄霉素抗性基因序列的融合片段I；其中，融合片段I中，LacZ基因左侧，氨苄霉素抗性基因右侧，以及LacZ基因、Cla1酶切位点、pBR322Ori位点和氨苄霉素抗性基因之间，还可分别包含0-数百个bp的连接序列；融合片段I两侧末端序列采用本领域常用方法进行设计以使其能与pAdEasy-1大片段通过Gibson法连接即可，即融合片段I两侧末端序列分别包括与pAdEasy-1大片段的两侧末端序列同源的序列，如融合片段I两侧末端序列分别与pAdEasy-1大片段的两侧末端序列同源，单侧同源序列长度为25-300bp；因Gibson法连接效率极高，上述单侧同源序列存在数个碱基的差异时，也可以通过Gibson法连接；将融合片段I与pAdEasy-1大片段通过Gibson法连接，得到pAd-Blue载体。Gibson法为DanielDGibson等人开发的一种用于DNA大片段拼接的技术，其主要思路是：对两段具有末端同源序列的DNA片段，通过核酸外切酶降解，切出粘性末端，两段DNA片段同源的粘性末端互补配对，再通过DNA聚合酶聚合、连接酶连接，便可将任意两段合适大小的DNA片段拼接起来。上述pAd-Blue载体的构建方法在一种可能的实现方式中，获得融合片段I的方法为本领域常规技术手段，有多种方法可选，如采用融合PCR法：将LacZ基因、Cla1酶切位点、pBR322Ori位点和氨苄霉素抗性基因序列及连接序列通过多重PCR得到融合片段I，多重PCR时，片段之间互相重合15本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种腺病毒包装方法在CRISPR/Cas9基因编辑方法中的应用，所述腺病毒包装方法包括：将pAdEasy‑1载体或根据pAdEasy‑1载体改造而成的载体，与携带有目的基因的pShuttle载体或携带有目的基因的根据pShuttle载体改造而成的载体，在体外进行连接，得到重组载体；进而转染AD293细胞系包装出携带目的基因的重组腺病毒。

【技术特征摘要】
1.一种腺病毒包装方法在CRISPR/Cas9基因编辑方法中的应用，所述腺病毒包装方法包括：将pAdEasy-1载体或根据pAdEasy-1载体改造而成的载体，与携带有目的基因的pShuttle载体或携带有目的基因的根据pShuttle载体改造而成的载体，在体外进行连接，得到重组载体；进而转染AD293细胞系包装出携带目的基因的重组腺病毒。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：根据pAdEasy-1载体改造而成的载体包括：pAd-Blue载体；所述pAd-Blue载体，其包括pAdEasy-1载体序列，和依次位于pAdEasy-1载体的Pac1酶切位点和pBR322Ori位点之间的LacZ基因和Cla1酶切位点；可选地，位于pAdEasy-1载体的Pac1酶切位点和pBR322Ori位点之间的序列包括SEQIDNO.1所示序列或其互补序列或其反向互补序列。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：根据pShuttle载体改造而成的载体包括：pBlue载体或pBlue载体的衍生载体；所述pBlue载体，其与pShuttle载体的区别在于：位于BamH1酶切位点和Xba1酶切位点之间的序列替换为依次包括L序列、限制性内切酶B酶切位点和R序列的序列；其中，限制性内切酶B酶切位点包括pBlue载体上自带的酶切位点之外的酶切位点；可选地包括：EcoR1，Bcl2，Bgl2，Xba1或Sal1中的至少一种；进一步可选地为EcoR1；L序列大小为10-300bp，包括与pAd-Blue载体上位于pBR322Ori位点左侧的Cla1酶切位点的左侧序列同源的序列；R序列大小为10-300bp，包括与pAd-Blue载体上位于氨苄霉素基因右侧的Cla1酶切位点的右侧序列同源的序列；可选地，L序列大小为10-40bp，40-150bp或150-250bp；R序列大小为10-40bp，40-150bp或150-250bp；进一步可选地，L序列包括SEQIDNO.9所示序列或其互补序列或其反向互补序列；R序列包括SEQIDNO.10所示序列或其互补序列或其反向互补序列；所述pBlue载体的衍生载体为：连接有外源基因的pBlue载体。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：在体外进行连接的方法包括：Gibson法。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述腺病毒包装方法包括下述步骤：限制性内切酶B酶切pBlue载体或pBlue载体的衍生载体；Cla1酶切pAd-Blue载体；通过Gibson法将线性化的pBlue载体或pBlue载体的衍生载体和Cla1酶切后的pAd-Blue载体连接，得重组载体；将重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞，利用卡那霉素和蓝白斑筛选阳性克隆；从阳性克隆中提取重组质粒，Pac1酶切，线性化重组质粒；将线性化后的重组质粒转染至AD293细胞系，数日后即可包装出携带外源基因的重组腺病毒。6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：pAd-Blue载体的构建方法包括：在pAdEasy-1载体的Pac1酶切位点和pBR322Ori位点之间插入依次包含LacZ基因和Cla1酶切位点的序列；可选地，pAd-Blue载体的构建方法包括：用Pac1和Cla1双酶切pAdEasy-1载体，取得到的pAdEasy-1大片段；获得包括LacZ基因、Cla1酶切位点、pBR322Ori位点和氨苄霉素抗性...

【专利技术属性】
技术研发人员：姬广聚，杨智广，顾磊，王会文，黄雪，黄海军，李静，
申请(专利权)人：中科广聚北京生物医学技术中心有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11