脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法、血管细胞及其应用技术

本发明专利技术涉及一种脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法、血管细胞及其应用。该脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法，包括以下步骤：用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞并培养，使得脂肪间充质干细胞发生重编程；及将重编程后的脂肪间充质干细胞置于血管细胞分化培养基中分化培养，得到血管细胞。上述方法能够将脂肪间充质干细胞直接转分化成血管细胞，且转分化的效率高。

METHODS, VASCULAR CELLS AND THEIR APPLICATION IN PREPARATION OF VASCULAR CELLS FROM TRANSDIFFERENTIATION OF ADipose-MEsenchymal STEM CELLS

【技术实现步骤摘要】
脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法、血管细胞及其应用
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法、血管细胞及其应用。
技术介绍
心脑血管疾病是心脏血管和脑血管疾病的统称，泛指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病。心脑血管疾病严重威胁人类的健康，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点。虽然通过传统药物及外科手术等手段重建血液运输系统，能够在一定程度上缓解心脑血管疾病的临床症状，但是这种治疗方法需要长期服用药物或经受手术的痛苦，且不能从根本上治疗心脑血管疾病。日本的ShinyaYamanaka于2006年首次公开通过Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4这4种转录因子导入小鼠成纤维细胞中，成纤维细胞经4种转录因子的诱导下进行基因的重新编排，得到一种与胚胎干细胞类似的细胞，命名为诱导性多能干细胞(iPS细胞，inducedpluripotentstemcells)。iPS细胞的发现将干细胞研的究和再生医学推向了一个全新的高度。通过iPS细胞治疗心脑血管疾病成为了研究的热门。然而，传统的方法一般是通过将成纤维细胞重编程为iPS细胞，再诱导iPS细胞分化成血管内皮细胞，操作繁琐和复杂，同时由于成纤维细胞转换为iPS细胞的效率较低，限制了iPS细胞向血管内皮细胞的分化，进而使得由成纤维细胞向血管细胞转化的效率较低，不能满足实际需要。
技术实现思路
基于此，有必提供一种脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法。该方法能够将脂肪间充质干细胞直接转分化成血管细胞，且转分化的效率高。此外，提供一种血管细胞及其应用。一种脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法，包括以下步骤：用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞，并于36℃～38℃下培养3小时～4小时，使得所述脂肪间充质干细胞发生重编程，其中，所述携带ETV2转录因子的腺病毒的病毒滴度为180PFU～240PFU；及将重编程后的所述脂肪间充质干细胞置于血管细胞分化培养基中分化培养，得到所述血管细胞。上述脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法，用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞，由于腺病毒无薄膜结构，不会诱发宿主的免疫反应，因此通过腺病毒携带ETV2转录因子的安全性较高。同时，用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞能够使脂肪间充质干细胞直接转分化成血管细胞，无需经过重编程为iPS细胞的过程，操作简单。在其中一个实施例中，所述将重编程后的所述脂肪间充质干细胞置于血管细胞分化培养基中分化培养的操作中，所述血管细胞分化培养基含有质量百分含量为2％～5％的培养添加物，所述培养添加物包括胎牛血清、肝素、人源内皮细胞生长因子、抗坏血酸及两性霉素B，培养时间为72小时～96小时。在其中一个实施例中，所述携带ETV2转录因子的腺病毒通过如下方法制备得到：将ETV2转录因子插入质粒pShuttle-CMV内，得到pShuttle-CMV-ETV2质粒；将所述pShuttle-CMV-ETV2质粒与pAdEasy-2质粒以摩尔比为1.5：1～2.5：1混合，并转入感受态细胞中，培养得到腺病毒重组质粒；及用所述腺病毒重组质粒转染293A细胞，培养转染后的所述293A细胞并收集培养上清，得到所述携带ETV2转录因子的腺病毒。在其中一个实施例中，所述将所述腺病毒重组质粒转染293A细胞，培养转染后的所述293A细胞并收集培养上清的操作具体如下：将所述腺病毒重组质粒线性化，用线性化的所述腺病毒重组质粒转染所述293A细胞，培养转染后的所述293A细胞并收集培养上清，得到原代腺病毒；用所述原代腺病毒转染所述293A细胞并培养，收集培养上清，得到二代腺病毒；及用所述二代腺病毒转染所述293A细胞并培养，收集培养上清，得到所述携带ETV2转录因子的腺病毒。在其中一个实施例中，所述用所述腺病毒重组质粒转染293A细胞的操作之前，预先培养所述293A细胞至汇合度为60％～70％。在其中一个实施例中，所述用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞的操作之前，还包括将所述脂肪间充质干细胞培养至汇合度为30％～40％。在其中一个实施例中，所述脂肪间充质干细胞为人脂肪间充质干细胞，所述血管细胞为血管内皮细胞。一种血管细胞，通过上述实施例任一项所述的脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法制备得到。如上述实施例所述的血管细胞在制备医用功能材料中的应用。一种治疗血管疾病的药物，包括上述实施例所述的血管细胞。附图说明图1为不同浓度的携带ETV2转录因子的腺病毒感染293T细胞的荧光5X视野对比图；图2为未感染的ASC细胞与ADV-ETV2感染的ASC细胞的明场10X视野对比图；图3为未感染的ASC细胞与ADV-ETV2感染的ASC细胞的FACS分析的对比图；图4为ADV-ETV2感染的ASC细胞转分化成的类血管内皮细胞中血管相关基因表达水平的示意图；图5为缺血小鼠模型的多普勒血流灌注成像图；图6为图5所示的缺血小鼠模型的A区域和B区域的血流灌注量的对比图；图7为给缺血小鼠模型分别注射PBS、ADSC、ADSC-Mcherry及ADSC-ETV2后的多普勒血流灌注成像图；图8为图7所示的小鼠右侧后肢的多普勒血流灌注成像图。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的较佳的实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。一实施方式的脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法包括如下操作S110～S120：S110、用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞，并于36℃～38℃下培养3小时～4小时，使得脂肪间充质干细胞发生重编程，其中，携带ETV2转录因子的腺病毒的病毒滴度为180PFU～240PFU。利用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞，使脂肪间充质干细胞被诱导而进行重编程，进而具有转分化的能力。在其中一个实施方式中，脂肪间充质干细胞为人的脂肪间充质干细胞。其中，ETV2转录因子即ETS变体基因2，是ETS转录因子家族成员之一，是一种含有EST结构域的转录因子。在本实施方式中，ETV2转录因子的序列参见ENSEMBL数据库，序列号为ENST00000402764。在其中一个实施方式中，S110包括如下操作S111～S112：S111、制备携带ETV2转录因子的腺病毒。由于腺病毒无薄膜结构，不会诱发宿主的免疫反应，因此通过腺病毒携带ETV2转录因子的安全性较高。具体地，将ETV2转录因子插入质粒pShuttle-CMV内，得到pShuttle-CMV-ETV2质粒；将pShuttle-CMV-ETV2质粒与pAdEasy-2质粒以摩尔比为1.5：1～2.5：1混合，并转入感受态细胞中，培养得到腺病毒重组质粒；用腺病本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞，并于36℃～38℃下培养3小时～4小时，使得所述脂肪间充质干细胞发生重编程，其中，所述携带ETV2转录因子的腺病毒的病毒滴度为180PFU～240PFU；及将重编程后的所述脂肪间充质干细胞置于血管细胞分化培养基中分化培养，得到所述血管细胞。

【技术特征摘要】
1.一种脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞，并于36℃～38℃下培养3小时～4小时，使得所述脂肪间充质干细胞发生重编程，其中，所述携带ETV2转录因子的腺病毒的病毒滴度为180PFU～240PFU；及将重编程后的所述脂肪间充质干细胞置于血管细胞分化培养基中分化培养，得到所述血管细胞。2.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法，其特征在于，所述将重编程后的所述脂肪间充质干细胞置于血管细胞分化培养基中分化培养的操作中，所述血管细胞分化培养基含有质量百分含量为2％～5％的培养添加物，所述培养添加物包括胎牛血清、肝素、人源内皮细胞生长因子、抗坏血酸及两性霉素B，培养时间为72小时～96小时。3.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法，其特征在于，所述携带ETV2转录因子的腺病毒通过如下方法制备得到：将ETV2转录因子插入质粒pShuttle-CMV内，得到pShuttle-CMV-ETV2质粒；将所述pShuttle-CMV-ETV2质粒与pAdEasy-2质粒以摩尔比为1.5：1～2.5：1混合，并转入感受态细胞中，培养得到腺病毒重组质粒；及用所述腺病毒重组质粒转染293A细胞，培养转染后的所述293A细胞并收集培养上清，得到所述携带ETV2转录因子的腺病毒。4.根据权利要求3所述的脂肪间...

【专利技术属性】
技术研发人员：林硕，李松，秦伟，
申请(专利权)人：深圳市伊思科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44