LDLR突变体的外泌体及制备方法与制备高脂血症药物的应用技术

本发明专利技术公开了一种LDLR突变体的外泌体及制备方法与制备高脂血症药物的应用，涉及治疗血脂异常药物技术领域。制备方法为将肝细胞接种在含有胎牛血清的培养基中，将过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的腺病毒转染肝细胞；突变体为低密度脂蛋白受体基因氧连接糖链结构域单碱基突变导致的终止突变；转染后，更换无血清培养基继续培养，再收集上清液；将所述上清液进行离心，去除漂浮活细胞，即得到含有外泌体的上清液；再进行分离纯化，得到过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体。本发明专利技术所述外泌体为内源细胞产生的天然载体，以外泌体作为转运载体，具有免疫源性低、运输效率高、稳定性好和靶向性强以及能跨越血脑屏障等独特优势。

The exosome of LDLR mutant and its preparation method and application in preparation of hyperlipidemia drugs

【技术实现步骤摘要】
LDLR突变体的外泌体及制备方法与制备高脂血症药物的应用
本专利技术涉及治疗血脂异常药物
，具体涉及一种过表达LDLR突变体的细胞外泌体及制备与应用，尤其是过表达人类低密度脂蛋白受体基因突变体(mutantlow-densitylipoproteinreceptor,mLDLR)的细胞外泌体及其制备方法和用于制备治疗血脂异常药物的应用。
技术介绍
血脂异常主要包括总胆固醇(Tch)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)升高和/或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低。纯合子家族性高胆固醇血症(HomozygousFamilialHypercholesterolemia,HoFH)是一类引起血脂异常的单基因病，HoFH患者低密度脂蛋白受体(low-densitylipoproteinreceptor,LDLR)表达降低，血清Tch与LDL-C水平显著升高，并导致动脉粥样硬化和心脑血管疾病。除单基因突变导致的血脂异常外，由于环境和生活方式的变化，2015年《中国居民营养与慢性病调查报告》显示2012年中国成人血脂异常患病率为40.40％，呈现为国民血脂异常的普遍暴露状态。血脂异常，特别是LDL-C或Tch升高是动脉粥样硬化性心血管疾病(导致全球致残致死的首要病因，包括冠心病、脑卒中和外周动脉疾病等)的重要危险因素。人群血清胆固醇水平升高将导致我国心血管病事件增加约920万(2010年～2030年)；而LDL-C水平每降低1mmol/L，全因病死率可下降19％，冠状动脉事件下降23％，心脏事件下降21％，降低LDL-C水平可稳定、延缓或消退动脉粥样硬化病变，并显著减少这些致死致残性疾病的发生率。因此，降低LDL-C水平是防控动脉粥样硬化性心血管病危险的首要干预靶点，发现并精准调控LDL-C水平的新型药物对维护人类健康具有重大意义。LDLR基因位于第19号染色体短臂(Chl9p13.1.13.3)，全长45kb，由18个外显子和17个内含子组成，编码含有839个氨基酸的前体蛋白。LDLR基因外显子区域可与LDLR蛋白7个结构域相对应：(1)启动子翻译信号区域；(2)外显子l编码的5’端序列及信号肽；(3)外显子2-6编码LDLR配体结合域；(4)外显子7-14编码EGF前体结构域；(5)外显子15编码LDLR氧连接糖链结构域；(6)外显子16和17编码跨膜结构域；(7)外显子17和18编码的胞浆区。细胞内新合成的LDLR前体由860个氨基酸残基组成，分子量120KDa，在由内质网向尔基体转运中，切去由21个氨基酸残基组成的信号肤，加上18个氧连接和2个氮连接的寡糖链，成熟LDLR分子量160KDa，于合成后约45分钟时到达细胞表面，并丛集于由细胞内陷形成的特殊有被小窝(coatediPt)内。外泌体是由细胞主动向细胞外分泌的双层囊泡小体，可携带多种蛋白质、核酸和脂质等在体液中循环，具有物质“运输载体”的作用，能够将内含物质运输到周围细胞中进行细胞间的物质运输和信息交流，从而参与多种生理及病理学过程。以外泌体作为转运载体，具有免疫源性低、运输效率高、稳定性好、靶向性强、并能跨越血脑屏障等独特优势。因此，以外泌体为载体，针对病因进行精准靶向治疗具有广阔的应用前景。专利ZL201711044797.5(LDLR基因突变体及其应用)中，公开了包含LDLR突变体的重组腺病毒注射LDLR-/-小鼠，可显著降低小鼠的血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，能够有效地用于筛选治疗高胆固醇血症的药物。但是，以腺病毒为载体的基因治疗具有一定的免疫源性，其感染靶细胞后，仍有少量病毒蛋白表达，从而作为异己抗原引发机体对腺病毒载体的特异性免疫反应。此外，腺病毒基因组不能整合到宿主细胞基因组上，外源基因易随着细胞分裂或死亡而消失，不能持续表达。
技术实现思路
本专利技术解决了现有技术中以腺病毒为载体进行治疗时产生的免疫原性治疗以及基因表达持续时间较短的问题，提供了一种过表达LDLR突变体的外泌体及制备与应用。按照本专利技术的第一方面，提供了一种过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体的制备方法，含有以下步骤：(1)将肝细胞接种在含有胎牛血清的培养基中培养，将过表达低密度脂蛋白受体基因突变体腺病毒转染所述肝细胞；所述突变体为低密度脂蛋白受体基因氧连接糖链结构域单碱基突变导致的终止突变；(2)待步骤(1)所述转染6h-8h后，更换无血清培养基继续培养48h-72h，再收集上清液；将所述上清液进行离心，去除漂浮活细胞，即得到含有外泌体的上清液；(3)将步骤(2)得到的含有外泌体的上清液进行分离纯化，得到过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体。优选地，所述低密度脂蛋白受体基因突变体与SEQIDNO:1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.G2146T、c.C2164T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T。优选地，所述外泌体与SEQIDNO:2相比，具有选自下列的突变：p.D716X、p.Q722X、p.E723X、p.K730X、p.Q739X、p.R744X或p.E763X。优选地，步骤(1)所述培养的时间为18h-24h，步骤(1)中待所述肝细胞生长至汇合率为30％-50％时，再将过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的腺病毒转染所述肝细胞。优选地，步骤(1)所述肝细胞为HepG2细胞系。按照本专利技术的另一方面，提供了所述方法制备得到的过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体。优选地，所述过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体为囊泡状，直径为30nm-200nm。按照本专利技术的另一方面，提供了所述过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体用于制备预防或治疗血脂异常药物中的应用。优选地，所述血脂异常为高脂血症。总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：(1)LDLR基因突变体(简称mLDLR)可表达生成LDLR突变蛋白，具有如下氨基酸序列，与SEQIDNO:2相比，所述分离的多肽具有选自下列的至少一种突变：p.D716X、p.Q722X、p.E723X、p.K730X、p.Q739X、p.R744X以及p.E763X。这些突变蛋白可以外泌体的形式分泌到细胞外，进入血液循环后结合LDL-C，通过内吞进入肝细胞并分解LDL-C，从而达到降低血LDL-C水平、治疗血脂异常的效果。(2)本专利技术优选地提供了一种过表达mLDLR蛋白的HepG2细胞外泌体，能够靶向肝脏部位，能够有效降低血液中LDL-C水平，发挥治疗血脂异常的作用。(3)外泌体是由细胞主动向外分泌的双层囊泡小体，可携带多种蛋白质、核酸和脂质等在体液中循环，具有物质“运输载体”的作用，能够将内含物质运输到周围细胞中进行细胞间的物质运输和信息交流，从而参与多种生理及病理学过程。本专利技术中外泌体在肝细胞中产生，因其为内源细胞产生的天然载体，可以与免疫系统有很好的生物适应性，应用于体内时，不易引起毒性与免疫反应。外泌体有自身天然的内含物，可以转移至受体细胞并功能性改变受体细胞，且不同来源的外泌体表面分子不一样，对受体细胞有一定选择性，在治疗上更有利。本专利技术所述外泌体为内源细胞产生的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体的制备方法，其特征在于，含有以下步骤：(1)将肝细胞接种在含有胎牛血清的培养基中培养，将过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的腺病毒转染所述肝细胞；所述突变体为低密度脂蛋白受体基因氧连接糖链结构域单碱基突变导致的终止突变；(2)待步骤(1)所述转染6h‑8h后，更换无血清培养基继续培养48h‑72h，再收集上清液；将所述上清液进行离心，去除漂浮活细胞，即得到含有外泌体的上清液；(3)将步骤(2)得到的含有外泌体的上清液进行分离纯化，得到过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体。

【技术特征摘要】
1.一种过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体的制备方法，其特征在于，含有以下步骤：(1)将肝细胞接种在含有胎牛血清的培养基中培养，将过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的腺病毒转染所述肝细胞；所述突变体为低密度脂蛋白受体基因氧连接糖链结构域单碱基突变导致的终止突变；(2)待步骤(1)所述转染6h-8h后，更换无血清培养基继续培养48h-72h，再收集上清液；将所述上清液进行离心，去除漂浮活细胞，即得到含有外泌体的上清液；(3)将步骤(2)得到的含有外泌体的上清液进行分离纯化，得到过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体。2.如权利要求1所述的过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述低密度脂蛋白受体基因突变体与SEQIDNO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.G2146T、c.C2164T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T。3.如权利要求1所述的过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述外泌体与SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：凃欣，周颖超，谢强，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42