高纯度和优异产量的正确折叠的依那西普制造技术

提供了一种用于从给定蛋白质的不正确折叠的构象中分离正确折叠的构象的混合模式色谱方法。所述方法在以商业上吸引人的产量从不正确折叠的依那西普和聚集体中分离正确折叠的依那西普方面是高度有效的，能够提供在正确折叠的依那西普对不正确折叠的依那西普方面具有非常高纯度的依那西普制备物。本发明专利技术进一步涉及通过本发明专利技术方法得到的含正确折叠的蛋白质的蛋白质制备物和制剂，和使用由所述混合模式方法得到的高纯度制备物治疗的方法。

Etanercept with Correct Folding for High Purity and Excellent Yield

【技术实现步骤摘要】
高纯度和优异产量的正确折叠的依那西普本申请是国际申请日为2013年9月10日，中国国家申请号为201380058650.5，专利技术名称为“高纯度和优异产量的正确折叠的依那西普”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术通常涉及用于纯化重组表达的蛋白质的层析分离方法，和从该方法得到的产物。更具体地，本专利技术涉及使用混合模式的层析法以纯化重组蛋白表达产物，包括，例如，可能包括不期望量的非正确折叠的和/或聚集的蛋白质和适当折叠的蛋白质的融合蛋白。本专利技术的混合模式层析方法特别有用于从不正确折叠的依那西普(如本文所定义的)中分离正确折叠的依那西普。本专利技术也涉及依那西普制备物和药物制剂，其中已使用本公开的方法高产率和高纯度地制备供应其中的依那西普。本专利技术进一步涉及采用高纯度的以非常低水平的错误折叠的/聚集的蛋白质为特征的依那西普治疗TNF病况的方法。
技术介绍
依那西普(ImmunexCorporation制造)是由与人类免疫球蛋白G(“IgG1”)的Fc受体[片段，可结晶的]区域连接的人类75千道尔顿(p75)肿瘤坏死因子受体(“TNFR”)的细胞外配体结合部分组成的二聚融合多肽。依那西普由934个氨基酸组成并具有约150千道尔顿的表观分子量(PhysiciansDeskReference,2002,MedicalEconomicsCompany,Inc.)。依那西普的Fc成分包含重链恒定结构域2(CH2)、重链恒定结构域3(CH3)和铰链区，但不包括人类IgG1的重链恒定结构域1(CH1)。一个Fc域可包括一个或所有的上述域。患有一些类型的炎性疾病例如风湿性关节炎、斑块状银屑病、银屑病关节炎、幼年特发性关节炎和强直性脊柱炎的人具有过度产生肿瘤坏死因子(“TNF”)的免疫系统。已发现施用依那西普对治疗一些炎性疾病是有效的，因为它可通过作为诱饵受体结合TNF而降低受试者中活化型TNF的水平。可通过重组DNA技术在中国仓鼠卵巢(“CHO”)的哺乳动物细胞表达系统中以已知的方式产生依那西普。不幸的是，由CHO细胞产生的产物包含大量的不正确或错误折叠和/或聚集的依那西普。对于药物应用，需要提供相对没有不正确折叠的和聚集的蛋白质的依那西普，因为所述不正确折叠的/聚集的蛋白质将不具有与正确折叠的蛋白质相同的治疗效果，且可能实际上对患者是有害的。错误折叠和聚集经常发生在产生重组蛋白的过程中，并因此必须通过能够从错误折叠或聚集的蛋白质中分离正确折叠的蛋白质的下游过程进行处理。错误折叠减少或消除蛋白质的治疗效果。通常被理解为涉及两种或更多种依那西普同源二聚体的非共价联合以形成非常高分子量物种的聚集导致相似的治疗效果的损失，且当蛋白质(包括错误折叠的蛋白质)积累并聚在一起时，聚集发生。如上所述，这样的错误折叠的蛋白质和蛋白质聚集体不仅是治疗无效的，也可能是对患者有害的。相应地，纯化含依那西普的蛋白质表达产物以使适当折叠的依那西普从错误和/或积聚的依那西普中分离的能力对于得到提供最高可能程度的药物可接受性的依那西普是重要的。错误折叠和聚集的蛋白质的产生不是特定于依那西普的问题。具有许多治疗性蛋白质，对其来说错误折叠可能是一个问题。例如，在来自大肠杆菌包涵体的重组蛋白重折叠的过程中，含二硫化物的蛋白质的错误折叠是难以避免的，但其可通过高分辨率的反相色谱法而被有效分离。然而，在反相色谱法中低pH和有机溶剂的使用在色谱分析过程中可使蛋白质变性并可能引起纯化的蛋白质的聚集。即使当错误折叠被认为在制备药物蛋白质中是可忽略的时，例如在哺乳动物分泌性表达的情况下，仍可能发生聚集和一些错误折叠(参见，例如，Chi,E.Y.,Krishnan,S.,Randolph,T.W.andCarpenter,J.F.,PhysicalStabilityofProteinsinAqueousSolution:MechanismandDrivingForcesinNonnativeProteinAggregation,Pharm.Res.,20,1325-1336(2003)；Kiese,S.,Pappenberger,A.,Friess,W.,andMahler,H.C.,Shaken,NotStirred:MechanicalStressTestingofanIgG1Antibody,J.Pharm.Sci.,97,4347-4366(2008))。研究者已在非变性条件下成功分离出非原生的、错误折叠的蛋白质，所述分离使用利用离子交换的水性色谱分析法(“IEC”)(参见，例如，Gagnon,P.J.,AntibodyAggregateRemovalbyHydroxyapatiteChromatographyinthePresenceofPolyethyleneGlycol,Immunol.Methods,336,222-228(2008)；Gagnon,P.,PurificationToolsforMonoclonalAntibodies,ValidatedBiosystems,Tucson,AZ,57-87(1996)；Shukla,A.A.,andYigzaw,Y.,ProcessScaleBioseparationsfortheBiopharmaceuticalIndustry,Shukla,A.,Etzel,M.,andGadam,S.,eds.,179-227,CRCPress,BocaRaton(2007)；Staby,A.,Jacobsen,J.H.,Hansen,R.G.,Bruus,U.K.,Jensen,I.H.,ComparisonofChromatographicIon-exchangeResins.V.StrongandWeakCation-ExchangeResins,J.Chromatogr.A,1118,168-179(2006)；Shukla,A.A.,Hubbard,B.,Tressel,T.,Guhan,S.,Low,D.J.,DownstreamProcessingofMonoclonalAntibodies-ApplicationofPlatformApproaches,Chromatogr.B,848,28-39(2007)；Shihara,T.,Kadoya,T.J.,AcceleratedPurificationProcessDevelopmentofMonoclonalAntibodiesforShorteningTimetoClinic:DesignandCaseStudyofChromatographyProcesses,Chromatogr.A,1176,149-156(2007)；Fahrner,R.L.,Knudsen,H.L.,Basey,C.D.,Galan,W.,Feuerhelm,D.,Vanderlaan,M.,Blank,G.S.,IndustrialPurificationofPharmaceuticalAntibodies:Development,Operation,andValidationofChromatographyProcesses,Biotechnol.Genet.E本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含依那西普的蛋白质混合物，其包含正确折叠的依那西普，所述正确折叠的依那西普的量构成多于约90wt.％的蛋白质混合物，其中所述蛋白质混合物的免疫原性低于商购的含依那西普的蛋白质混合物。

【技术特征摘要】
2012.09.11 US 61/699,5521.一种含依那西普的蛋白质混合物，其包含正确折叠的依那西普，所述正确折叠的依那西普的量构成多于约90wt.％的蛋白质混合物，其中所述蛋白质混合物的免疫原性低于商购的含依那西普的蛋白质混合物。2.一种药学上可接受的制剂，其包含权利要求1所述的含依那西普的蛋白质混合物。3.根据权利要求2所述的药学上可接受的制剂，其中所述正确折叠的依那西普构成约25至约75mg/ml的蛋白质混合物。4.根据权利要求2所述的药学上可接受的制剂，其还包含缓冲剂。5.根据权利要求2所述的药学上可接受的制剂，其还包含张力调节剂。6.根据权利要求2所述的药学上可接受的制剂，其还包含糖、多元醇或者糖和多元醇两者。7.根据权利要求2所述的药学上可接受的制剂，其还包含氨基酸。8.根据权利要求2所述的药学上可接受的制剂，其还包含表面活性剂。9.根据权利要求2所述的药学上可接受的制剂，其中所述制剂不含精氨酸。10.根据权利要求2所述的药学上可接受的制剂，其中所述制剂具有约5.8至约8.4的pH。11.根据权利要求2所述的药学上可接受的制剂，其中所述制剂具有约180至约420mOsM的渗透度。12.根据权利要求3所述的药学上可接受的制剂，其还包含缓冲剂、张力调节剂和表面活性剂；其中所述制剂具有约5.8至8.4的pH。13.根据权利要求12所述的药学上可接受的制剂，其中所述制剂不含精氨酸。14.一种治疗患有TNF介导的疾病的受试者的方法，其包含向该受试者施用权利要求2所述的药学上可接受的制剂。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述TNF介导的...

【专利技术属性】
技术研发人员：荒川力，道格拉斯·法勒，
申请(专利权)人：科荣生生物科学公司，
类型：发明
国别省市：美国,US