ApoD在制备帕金森病药物中的应用、ApoD制剂及其制备方法技术

本发明专利技术公开了载脂蛋白D(ApoD)在制备帕金森病药物中的应用、ApoD口服制剂及其制备方法，所述ApoD口服制剂的制备方法包括以下步骤：S1、内层脂质体制备：将脂质体原料进行混合，进行旋转减压蒸发吹干，加入ApoD、辅料、乙醚溶液，进行超声搅拌得到脂质体I；S2、脂质体的修饰：将巯基化处理后的转铁蛋白受体抗体OX26加入到向脂质体I中，进行偶联反应，将OX26抗体连接至脂质体I上，得到脂质体II后进行层析处理；S3、在脂质体II的外层结合壳聚糖层，制备复合脂质体III。本发明专利技术首次公开了ApoD在制备帕金森病药物中的应用，开拓了ApoD在帕金森病药物领域的应用价值，提供了全新的帕金森病药物类型—ApoD口服制剂，该制剂药的靶向效果好、不易被降解、药效持续时间长。

Application of ApoD in the Preparation of Parkinson's Disease Drugs, ApoD Preparations and Their Preparations

【技术实现步骤摘要】
ApoD在制备帕金森病药物中的应用、ApoD制剂及其制备方法
本专利技术涉及载脂蛋白D的药物研究领域，尤其涉及ApoD在制备帕金森病药物中的应用、ApoD制剂及其制备方法。
技术介绍
帕金森病和帕金森综合征(Parkinson，PD)是临床常见病，是一种老年退行性脑病，是以进行性运动功能障碍为主要临床表现的中枢神经系统退行性病变，震颤、僵直及运动减少是其最主要的临床表现。而该病的患病率呈迅速增高的趋势，但是其治愈率低。而目前市面的ApoD的药种类多，或疗效不佳，或具有一定的不良反应，人们急切地需要开发更好的治疗药物。ApoD，即载脂蛋白D，在结构上与其他类型的载脂蛋白存在很大的差异，被归入脂肪促成素家族。其研究已有20多年的历史，以其结构、表达以及调控、功能等方面的基础研究为主，人们不断开发载脂蛋白D的作用机制和应用价值，目前已利用ApoD的免疫反应进行心血管疾病、癌症的早期预测和诊断。但是目前，ApoD的药物开发尚少，其药用价值并未被充分利用。目前尚无任何研究发现ApoD作为活性成分在帕金森病领域的应用，而ApoD在制备帕金森病药物的应用是开拓性的发现，应用前景广阔。
技术实现思路
针对ApoD的药用价值并未被充分开发和利用，本专利技术提供了ApoD在制备帕金森病药物中的应用，并进一步地提供了一种治疗帕金森病的ApoD口服制剂及其制备方法，这种ApoD口服制剂的药用价值高、对治疗部位的靶向效果好、不易被降解，药效持续时间长。为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供ApoD在制备帕金森病药物中的应用。本专利技术还提供了一种用于治疗帕金森病的ApoD口服制剂的制备方法，其包括以下步骤：S1、内层脂质体制备：将脂质体原料进行混合，进行旋转减压蒸发吹干；加入ApoD、辅料、乙醚溶液，进行超声搅拌8-15min，温度为10-20℃，得到脂质体I。形成的球形脂质体将ApoD和辅料进行包埋，避免ApoD经过肠胃时就被胃蛋白酶和胰蛋白酶所降解，降低药效，并且脂质体层能帮助ApoD进行跨膜运动，提高ApoD向靶位点的运输效率。S2、内层脂质体的免疫修饰：将转铁蛋白受体抗体OX26进行巯基化处理，向脂质体I中加入巯基化的OX26，室温下进行10-14h的偶联反应，将OX26抗体连接至脂质体I上，得到脂质体II，通过层析对脂质体II进行分离纯化。脑血屏障的脑毛血管内皮细胞上表达大量的转帖蛋白受体，内层脂质体上结合的转铁蛋白受体抗体OX26，基于特异性地免疫结合，可靶向性地运输至脑血屏障并进入脑内，并将脂质体转运至病变的目标脑细胞内，并向其释放ApoD，起到靶向治疗的作用。S3、复合脂质体的制备：制备质量体积百分比为1-5％的壳聚糖的溶液，并向其加入0.1％(V/V)的乳化剂Tween-80后混匀得到混合液，用注射器将脂质体II溶液快速打入到混合液中，旋涡震荡后的悬浊液在氮气环境下，10-20℃条件下，进行旋转蒸发20-30min，得到复合脂质体III，得到ApoD口服制剂。通过上述方法，对脂质体II的外层结合保护性的壳聚糖层，增加其抗胰蛋白酶降解的性能。进一步提高脂质体制剂的稳定性和水溶形。优选地，所述ApoD口服制剂的制备方法中，脂质体原料包括：30-50mmol·L-1的卵磷脂和30-50mmol·L-1的胆固醇。优选地，S1步骤中，脂质体进行PEG修饰。上述经PEG修饰的脂质体原料制备的脂质体，相较于未修饰的脂质体原料，其结构更稳定，半衰期长，提高ApoD口服制剂的缓释效果，延长药物作用时间。所述ApoD口服制剂的制备方法中，所述辅料为蛋白酶抑制剂PMSF。与ApoD一起被包埋于脂质体内的蛋白酶抑制剂PMSF，作为最后一道防线，避免ApoD进入靶细胞后，被细胞靶内的蛋白酶所降解。所述ApoD口服制剂的制备方法中，S3步骤后，将得到的脂质体III采用0.22um的微孔滤膜进行除菌处理。这种除菌操作方法简单，效率高，耗时短，并且不破坏脂质体结构。本专利技术还提供一种用于治疗帕金森病的ApoD口服制剂，该制剂以ApoD为活性成分，为双层脂质体剂型，采用上述的制备方法制备而成。该制剂为口服制剂。本专利技术具有以下有益效果：1、首次公开了ApoD在制备帕金森病药物中的应用：首次发现ApoD对帕金森病的治疗疗效，开拓了ApoD在帕金森病药物领域的应用价值，提供了一种全新的帕金森病药物类型，为帕金森病新药的研发开辟新方向，奠定坚实基础。2、提供了一种治疗帕金森病的ApoD口服制剂及其制备方法，通过脂质体法对活性成分ApoD进行包埋处理，提高了制剂的脂溶性和跨膜运输能力，对ApoD起到保护作用，避免其受到胃肠道蛋白酶的分解，并提高进入脑血屏障能力；脂质体的PEG修饰进一步地提高脂质体的结构稳定性，延长其在体内循环时间，提高缓释性能；脂质体上结合的转铁蛋白受体抗体OX26，能特异性地结合脑血脑血屏障的脑毛血管内皮细胞，提高ApoD口服制剂的脑组织靶向性，提高其靶向治疗效果。3、通过PD细胞模型的药理实验，证明：ApoD和ApoD口服制剂能显著提高MPP+诱导的C6细胞存活率，可能是通过拮抗MPP+诱导的C6细胞线粒体膜电位的降低、拮抗MPP+诱导的C6细胞活性氧ROS的升高，从而改善由线粒体功能障碍导致的氧化应激反应，缓解神经细胞损伤。而PD转基因模型小鼠的行为学实验，进一步地验证：ApoD和ApoD口服制剂能明显改善PD小鼠运动协调性，缩短爬杆时间，增强小鼠悬挂和自主活动能力，改善帕金森病的症状，对其具有治疗效果。附图说明图1为本专利技术实施例中ApoD制剂提高MPP+诱导的C6细胞存活率的实验结果；图2为本专利技术实施例中ApoD制剂拮抗MPP+诱导的C6细胞线粒体膜电位(ΔΨm)的降低的实验结果；图3为本专利技术实施例中ApoD口服制剂拮抗MPP+诱导的C6细胞活性氧ROS升高的实验结果；其中，C组和Control组为对照组，MPP+组为仅经过MPP+处理24h的模型组，A1组：施加ApoD，再加MPP+共孵育；A2组和A3组分别施加低剂量和高剂量ApoD制剂后，再加MPP+共孵育24hrs；测试结果与模型组相比，#标记代表P<0.05,##代表P<0.01,###代表P<0.001。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本专利技术。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本专利技术不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。实验材料ApoD：BioVendor公司的ApolipoproteinDhumanHEK293。转铁受体抗体(OX26，Abcam公司)、2-亚氨氢氯化硫醇Traut’s试剂盒(PIERCE公司)。ApoD口服本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.ApoD在制备帕金森病药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.ApoD在制备帕金森病药物中的应用。2.一种用于治疗帕金森病的ApoD口服制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、内层脂质体制备：将脂质体原料进行混合，进行旋转减压蒸发吹干；加入ApoD、辅料、乙醚溶液，进行超声搅拌8-15min，温度为10-20℃，得到脂质体I；S2、内层脂质体的免疫修饰：将转铁蛋白受体抗体OX26进行巯基化处理，向脂质体I中加入巯基化的OX26，室温下进行10-14h的偶联反应，将OX26抗体连接至脂质体I上，得到脂质体II，通过层析对脂质体II进行分离纯化；S3、复合脂质体的制备：制备质量体积百分比为1-5％的壳聚糖的溶液，并向其加入0.1％(V/V)的乳化剂Tween-80后混匀得到混合液，用注射器将脂质体II溶液快速打入到混合液中，旋涡震荡后的悬浊液在氮气环境下，10-...

【专利技术属性】
技术研发人员：阎春玲，姜宏，杜希恂，焦倩，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东,37