一种登革病毒IgG/IgM抗体检测试纸条、试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种登革病毒IgG/IgM抗体检测试纸条、试剂盒及其制备方法，涉及登革病毒检测技术领域。本发明专利技术公开的登革病毒IgG/IgM抗体检测试纸条，包括依次贴于聚氯乙烯底部上的样品垫、包被了胶体金标记的登革病毒重组抗原和鸡Ig Y多抗的免疫结合垫、包被了登革病毒抗人IgM抗体、IgG抗体的检测线和抗鸡IgY多抗的质控线的硝酸纤维素膜和吸水纸；该试纸条可通过检测标记物的方法检测待检样品中是否存在登革病毒IgG/IgM抗体；该试纸条和包括有该试纸条的检测卡可作为登革病毒早期急性感染抗原检测的的补充，覆盖病程的中后期，减少漏检的风险。

A test strip, kit and preparation method for dengue virus IgG/IgM antibody detection

【技术实现步骤摘要】
一种登革病毒IgG/IgM抗体检测试纸条、试剂盒及其制备方法
：本专利技术属于体外诊断
，具体涉及生物检测
，特别涉及一种登革病毒IgG/IgM抗体检测试剂盒的制备方法。
技术介绍
：登革热是由登革热病毒引起的一种急性传染病，以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介，具有传播迅猛、发病率高、人群普遍易感、重症类型死亡率高等特点，被认为是全球最受关注的传染病。目前在非洲、美洲、东地中海、东南亚和西太平洋100多个国家呈地方性流行，东南亚和西太平洋地区受DV(登革病毒)影响更为严重。大约2.5亿人生活在登革热流行国家，感染DV后可发生登革热、登革出血热(DHF)或登革休克综合征(DSS)。每年估计有5000万以上的登革热感染发生，其中50万人因患登革热需住院治疗，感染者中约2.5％发生死亡。在我国，登革热具有典型的输入性和突发性，在发生时常常表现为较大范围、较严重的暴发流行等特点。按照《中华人民共和国传染病防治法》的规定为乙类传染病。近年来，登革热在我国本地暴发流行区域主要集中在广东、云南、浙江、广西、福建省(自治区)等东南沿海和边境省份，而输入病例在我国多数省份有分布。2014年我国登革热爆发时病例的发生数量超过45000例。登革病毒有四个血清型，在一个地区往往存在不同血清型病毒的交替流行，这更增加了登革出血热和登革休克综合征发生的可能性。登革出血热和登革休克综合征的病死率较高，不仅严重影响人民的身体健康，增加医疗负担，而且严重影响居民生活和旅游业的发展，进而影响当地的经济发展，同时由于控制不当还会造成大量的杀虫剂浪费，导致环境污染，严重影响人类和环境健康，也能诱发媒介生物抗药性。在感染登革热早期阶段，登革病毒以抗原形式存在，是存在于感染病人血清中的一个糖蛋白。而在中后期登革病毒感染可导致机体产生免疫应答，并产生病毒特异性抗体。首次感染登革病毒后，发病第5-10天可检测到IgM抗体，其抗体水平在1～2周内上升至最高，此后缓慢下降，可维持2～3个月，直至检测不到；发病1周后可检出IgG抗体，IgG抗体可维持数年甚至终生。二次感染表现为感染发作后的1～2天特异性IgG水平升高，还经常伴有IgM水平的升高。因此，登革病毒IgG/IgM抗体检测试剂盒可作为早期急性感染抗原检测的的补充，覆盖病程的中后期，减少漏检的风险。登革热的检测对象为媒介标本(伊蚊成蚊和幼虫)、疑似和临床诊断病例(按照登革热诊断标准WS216-2008)。媒介标本检测分为核酸检测和病毒分离两种方法。疑似和临床诊断病例检测，包括病原学检测和血清学检测。由于目前尚无特效的抗病毒治疗药物，主要采取支持及对症治疗措施。治疗原则是早发现、早诊断、早治疗、早防蚊隔离。而目前，市面上缺乏针对登革病毒检测的试剂盒。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种登革病毒IgG/IgM抗体检测试纸条和包括该试纸条的检测卡。该登革病毒IgG/IgM抗体检测试纸条和检测卡可特异快速地进行登革病毒中后期感染的检测与诊断，减低成本，检测速度快。本专利技术的另一目的在于提供上述登革病毒IgG/IgM抗体检测试纸条和包括该试纸条的检测卡的制备方法。该制备方法得到的登革病毒IgG/IgM抗体检测试纸条和检测卡应用简便，结果准确，为下一步准确治疗由登革病毒引起的疾病提供了依据，适于大规模推广应用。本专利技术的另一目的在于提供含有上述登革病毒IgG/IgM抗体检测卡的试剂盒。该试剂盒可特异快速地进行登革病毒中后期感染的检测与诊断，减低成本，快速检测，有效满足临床使用的需要。为实现上述目的，本专利技术提供了一种登革病毒IgG/IgM抗体检测试纸条的制备方法采用了如下的技术方案：a.用氯化金溶液和柠檬酸三钠溶液制备胶体金溶液；b.碳酸钾调节步骤a得到的胶体金溶液的pH至6.5-9.0，依次加入登革病毒重组抗原、牛血清白蛋白溶液，离心得到沉淀，重悬液重悬沉淀得到胶体金标记的登革病毒重组抗原溶液；c.碳酸钾调节步骤a得到的胶体金溶液的pH至6.5-8.0，依次加入鸡IgY抗原、牛血清白蛋白溶液，离心得到沉淀，重悬液重悬沉淀得到胶体金标记的鸡IgY抗原溶液；d.用结合垫处理液均匀喷涂在结合垫上进行预处理，预处理结束后用步骤b和c得到的胶体金标记的登革病毒重组抗原溶液和得到的胶体金标记的鸡IgY抗原溶液的混合溶液对结合垫喷金得到免疫结合垫，喷金结束后将免疫结合垫置于室温，湿度≤30％条件下干燥1小时，然后0.1Mpa下真空干燥1小时；e.用包被缓冲液稀释抗人IgM抗体得到检测线T1工作液；用包被缓冲液稀释抗人IgG抗体得到检测线T2工作液；用包被缓冲液稀释抗鸡IgY多抗得到质控线工作液；用检测线T1工作液、检测线T2工作液和质控线工作液分别在贴于聚氯乙烯底板的硝酸纤维素膜上划线，划膜结束后将膜置于37℃-60℃干燥箱中干燥24小时；f.用样品垫处理液均匀喷涂在样品垫上进行预处理；g.将样品垫和免疫结合垫贴于划膜的硝酸纤维素膜下方，将吸水纸贴于划膜的硝酸纤维素膜的上方得到登革病毒IgG/IgM抗体检测试纸条；优选地，上述技术方案中步骤a所述的具体制备步骤为：称取990g水于三角烧瓶中，加入10ml浓度为2％的氯化金溶液，即溶液中氯化金的终浓度为0.02％，将烧瓶置于磁力搅拌器上加热至沸腾，迅速加入13ml浓度为2％的柠檬酸三钠溶液，待溶液变为红棕色后继续加热沸腾5分钟，静置至恢复室温，置于4℃保存待用。优选地，上述技术方案中步骤b所述的具体步骤为：将胶体金溶液中加入0.2M碳酸钾，混匀调节pH至6.5-9.0，然后加入登革病毒重组抗原，继续搅拌30min，再加入2ml10％牛血清白蛋白溶液，继续搅拌30min，在4℃、转速为8000g的条件下离心30min得到沉淀，沉淀用1ml重悬液复溶。优选地，上述技术方案中步骤c所述的具体步骤是将胶体金溶液中加入0.2M碳酸钾，混匀调节pH至6.5-8.0，然后加入鸡IgY抗原，继续搅拌30min，再加入2ml10％牛血清白蛋白溶液，继续搅拌30min，在4℃、转速为8000g的条件下离心30min得到沉淀，沉淀用1ml重悬液复溶。优选地，上述技术方案中，所述重悬液为0.01M磷酸盐缓冲液，每100ml磷酸盐缓冲液包含lg牛血清白蛋白和10g海藻糖、0.05％NaN3，pH7.0±0.1。优选地，上述技术方案中，步骤d所述的免疫结合垫采用玻璃纤维膜或聚酯纤维膜。优选地，上述技术方案中，步骤d所述结合垫处理液为硼酸-四硼酸钠缓冲体系，每100ml结合垫处理液含0.9g硼酸、0.6g四硼酸钠、3g海藻糖、3g蔗糖、0.5gBSA、0.5g酪蛋白钠、10mg阻断剂、0.2％Tween80、0.05％NaN3，pH8.6±0.1。优选地，上述技术方案中，步骤e中所述的包被缓冲液为Tris缓冲体系，每100ml包被缓冲液含1.2lgTris、0.5g氯化钠、3g蔗糖、0.05％NaN3，pH8.6±0.1。优选地，上述技术方案中，步骤e中所述检测线T1工作液浓度为1.0mg/mL；所述检测线T2工作液浓度为1.0mg/mL；所述质控线工作液浓度为1.5mg/ml。优选地，上述技术方案中，步骤f中所述样品垫采用玻璃纤维膜或聚酯纤维膜。优选地，上述技术方案中，步骤f中所述样品垫本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种登革病毒IgG/IgM抗体检测试纸条的制备方法,其特征在于,包括以下步骤：a.用氯化金溶液和柠檬酸三钠溶液制备胶体金溶液；b.碳酸钾调节步骤a得到的胶体金溶液的pH至6.5‑9.0，依次加入登革病毒重组抗原、牛血清白蛋白溶液，离心得到沉淀，重悬液重悬沉淀得到胶体金标记的登革病毒重组抗原溶液；c.碳酸钾调节步骤a得到的胶体金溶液的pH至6.5‑8.0，依次加入鸡IgY抗原、牛血清白蛋白溶液，离心得到沉淀，重悬液重悬沉淀得到胶体金标记的鸡IgY抗原溶液；d. 用结合垫处理液均匀喷涂在结合垫上进行预处理，预处理结束后用步骤b和c得到的胶体金标记的登革病毒重组抗原溶液和胶体金标记的鸡IgY抗原溶液的混合溶液对结合垫喷金得到免疫结合垫,喷金结束后将免疫结合垫置于室温，湿度≤30%条件下干燥1小时，然后在0.1Mpa条件下真空干燥1小时；e.用包被缓冲液稀释抗人IgM抗体得到检测线T1工作液；用包被缓冲液稀释抗人IgG抗体得到检测线T2工作液；用包被缓冲液稀释抗鸡IgY多抗得到质控线工作液；用检测线T1工作液、检测线T2工作液和质控线工作液分别在贴于37℃‑60℃干燥箱中干燥24小时；f.用样品垫处理液均匀喷涂在样品垫上进行预处理；g.将样品垫和免疫结合垫贴于划膜的硝酸纤维素膜下方，将吸水纸贴于划膜的硝酸纤维素膜的上方得到登革病毒IgG/IgM抗体检测试纸条。...

【技术特征摘要】
1.一种登革病毒IgG/IgM抗体检测试纸条的制备方法,其特征在于,包括以下步骤：a.用氯化金溶液和柠檬酸三钠溶液制备胶体金溶液；b.碳酸钾调节步骤a得到的胶体金溶液的pH至6.5-9.0，依次加入登革病毒重组抗原、牛血清白蛋白溶液，离心得到沉淀，重悬液重悬沉淀得到胶体金标记的登革病毒重组抗原溶液；c.碳酸钾调节步骤a得到的胶体金溶液的pH至6.5-8.0，依次加入鸡IgY抗原、牛血清白蛋白溶液，离心得到沉淀，重悬液重悬沉淀得到胶体金标记的鸡IgY抗原溶液；d.用结合垫处理液均匀喷涂在结合垫上进行预处理，预处理结束后用步骤b和c得到的胶体金标记的登革病毒重组抗原溶液和胶体金标记的鸡IgY抗原溶液的混合溶液对结合垫喷金得到免疫结合垫,喷金结束后将免疫结合垫置于室温，湿度≤30%条件下干燥1小时，然后在0.1Mpa条件下真空干燥1小时；e.用包被缓冲液稀释抗人IgM抗体得到检测线T1工作液；用包被缓冲液稀释抗人IgG抗体得到检测线T2工作液；用包被缓冲液稀释抗鸡IgY多抗得到质控线工作液；用检测线T1工作液、检测线T2工作液和质控线工作液分别在贴于37℃-60℃干燥箱中干燥24小时；f.用样品垫处理液均匀喷涂在样品垫上进行预处理；g.将样品垫和免疫结合垫贴于划膜的硝酸纤维素膜下方，将吸水纸贴于划膜的硝酸纤维素膜的上方得到登革病毒IgG/IgM抗体检测试纸条。2.根据权利要求1所述的登革病毒IgG/IgM抗体检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤a所述的具体制备步骤为称取990g水于三角烧瓶中，加入10ml浓度为2%的氯化金溶液，即溶液中氯化金的终浓度为0.02%，将烧瓶置于磁力搅拌器上加热至沸腾，迅速加入13ml浓度为2%的柠檬酸三钠溶液，待溶液变为红棕色后继续加热沸腾5分钟，静置至恢复室温，置于4℃保存待用。3.根据权利要求1所述的登革病毒IgG/IgM抗体检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤b所述的具体步骤是将胶体金溶液中加入0.2M碳酸钾，混匀调节pH至6.5-9.0，然后加入登革病毒重组抗原，继续搅拌30min，再加入2ml10%牛血清白蛋白溶液，继续搅拌30min，在4℃、转速为8000g的条件下离心30min得到沉淀，沉淀用1ml重悬液复溶。4.根据权利要求1所述的登革病毒IgG/IgM抗体检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤c所述的具体步骤是将胶体金溶液中加入0.2M碳酸钾，混匀调节pH至6.5-8.0，然后加入鸡IgY抗原，继续搅拌30min，再加入2ml10%牛血清白蛋白溶液，继续搅拌30min，在4℃、转速为8000g的条件下离心30min得到沉淀，沉淀用1ml重悬液复溶。5.根据权利要求1或3或4所述的登革病毒IgG/IgM抗体检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述重悬液为0.01M磷酸盐缓冲液，每100ml磷酸盐缓冲液包含1g牛血清白蛋白和10g海藻糖、0.05%NaN3，pH7.0±0.1。6.根据权利要求1所述的登革病毒IgG/IgM抗体检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤d所述的免疫结合垫采用玻璃纤维膜或聚酯纤维膜。7.根据权利要求1所述的登革病毒IgG/IgM抗体检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤d所述结合垫处理液为硼酸-四硼酸钠缓冲体系，每100ml结合垫处理液含0...

【专利技术属性】
技术研发人员：童国权，杨标，金巍，刘中华，王国强，
申请(专利权)人：江苏硕世生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32