一种禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒及其应用方法技术

本发明专利技术公开了一种禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒及其应用方法，其包括，单克隆抗体H5‑M5、H7‑M4和NP‑M1。本发明专利技术蛋白抗体诊断芯片用于快速地确定不同种属动物体内是否存在禽流感病毒NP蛋白抗体，且能同时区分禽流感病毒的H5和H7亚型，以达到对禽流感及禽流感的H5、H7亚型进行早期鉴别诊断以及疫情监测的目的，并能检测不同种属，从而为禽流感诊断提供一种新方法。

A Kit for Detecting Antibodies to H5, H7 and NP Proteins of Avian Influenza and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒及其应用方法
本专利技术属于免疫学检测
，具体涉及一种禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒及其应用方法。
技术介绍
流感病毒(Influenzavirus)是一种极为常见的呼吸道病毒，它在病毒分类学上属正粘病毒科(Orthomyxoviridae)。它的基因组是分节段的单股负链RNA，由于流感病毒膜蛋白(MP)和核蛋白(NP)抗原特性及其基因特性的不同，所以流感病毒被分为甲、乙、丙三型。甲型和乙型流感病毒的基因由8个节段组成，丙型流感病毒比甲型和乙型流感病毒少了一个节段，甲型流感病毒又根据其表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白结构和其基因特性可分成许多的亚型。禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)属于甲型流感病，根据禽流感病毒致病性和毒力的不同，可以将禽流感分为高致病性禽流感(Highpathogenicavianinfluenza，HPAI))、低致病性禽流感(Lowpathogenicavianinfluenza，LPAI)和无致病性禽流感(Nopathogenicavianinfluenza，NPAIV)。我国长期监测流感病毒证实，在我国家禽和水禽中同时存在多种亚型的禽流感病毒，不同亚型禽流感病毒之间基因重组频繁发生，导致新的病毒株不断产生。高致病性禽流感仅限于H5和H7亚型，它们不仅对全球的经济造成了巨大的影响，还对人类的健康产生了严重的威胁。禽流感的检测技术主要分为分子生物学诊断和血清学诊断技术两大方面。分子生物学诊断技术包括反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，依赖核酸序列的扩增(NASBA)，核酸分子杂交技术，环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)，基因芯片(DNA微阵列)等。血清学诊断技术包括琼脂凝胶扩散试验(AGID)，血凝和血凝抑制试验(HA/HI)，神经氨酸酶抑制试验(NIT)，病毒中和试验(VNT)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，免疫荧光技术(IFA)等。现有ELISA试剂盒只能检测一种抗原，无法同时检测多种抗原，其他的蛋白芯片虽然能检测出多种抗原的抗体，但是只能检测一个种属，如果要检测不同种属需要更换不同的二抗，给实验带来不便，因此，如何开发一种不必更换抗体即可检测多个种属并同时检测多种抗原的方法，是有待解决的技术问题。
技术实现思路
本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。鉴于上述的技术缺陷，提出了本专利技术。因此，作为本专利技术其中一个方面，本专利技术克服现有技术中存在的不足，提供一种禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒。为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒，其包括，单克隆抗体H5-M5、H7-M4和NP-M1。作为本专利技术所述的禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒的一种优选方案：还包括，AIV-H3N2的NP蛋白、AIV-H5N1的HA蛋白、AIV-H7N9的HA蛋白，和/或其包被的蛋白芯片反应板。作为本专利技术所述的禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒的一种优选方案：还包括，IgG酶标抗体。作为本专利技术所述的禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒的一种优选方案：所述IgG酶标抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体。作为本专利技术所述的禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒的一种优选方案：还包括，洗涤液、阳性对照样品、阴性对照样品、化学发光底物。作为本专利技术所述的禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒的一种优选方案：所述洗涤液包括TBST洗涤液，所述TBST洗涤液包括含Tween-20的TBS，pH为7～7.5。作为本专利技术所述的禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒的一种优选方案：所述阳性对照样品为抗AIV-H5及AIV-H7的混合鸡血清，所述阴性对照样品为阴性鸡血清。作为本专利技术的另一个方面，本专利技术提供所述的禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒的应用方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：所述的禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒的应用方法，其包括，AIV蛋白芯片的制备：AIV-H3N2的NP蛋白、AIV-H5N1的HA蛋白、AIV-H7N9的HA蛋白用包被液稀释后，蛋白芯片点样；血清孵育：孵育待测样品及阳性对照样品和阴性对照样品；单抗孵育：孵育所述单克隆抗体；二抗孵育：孵育所述IgG酶标抗体；检测：化学发光法检测。作为本专利技术所述的禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒的应用方法的一种优选方案：所述AIV蛋白芯片的制备，还包括将所述AIV-H3N2的NP蛋白、AIV-H5N1的HA蛋白、AIV-H7N9的HA蛋白溶解在含有30％乙腈水溶液中，点样缓冲液配方包括0.3MPB、0.2％Glycerin、0.01％Tritonand、1.5％Mannitol。作为本专利技术所述的禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒的应用方法的一种优选方案：所述孵育，温度均为37℃；所述检测，鸡血清的结果判定为：H5>40％为阳性，H7>40％为阳性，NP>50％为阳性；鸭血清的结果判定为：H5>30％为阳性，H7>40％为阳性，NP>20％为阳性；孔雀血清的结果判定为：H5>50％为阳性，H7>50％为阳性，NP>50％为阳性。本专利技术的有益效果：本专利技术蛋白抗体诊断芯片用于快速地确定不同种属动物体内是否存在禽流感病毒NP蛋白抗体，且能同时区分禽流感病毒的H5和H7亚型，以达到对禽流感及禽流感的H5、H7亚型进行早期鉴别诊断以及疫情监测的目的，并能检测不同种属，从而为禽流感诊断提供一种新方法。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：图1为蛋白点样浓度(A-C)，抗体稀释倍数(D-F)和血清稀释倍数(G-I)的选择。图2为样本血清孵育时间。图3为检测临界值的确定。图4为蛋白芯片方法的特异性。图5为蛋白芯片方法的敏感性。图6单克隆抗体的筛选。具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是本专利技术还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似推广，因此本专利技术不受下面公开的具体实施例的限制。其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本专利技术至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。本专利技术用于禽流感抗体检测且能同时用于流感亚型鉴定的试剂盒，为临床禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于：包括，单克隆抗体H5‑M5、H7‑M4和NP‑M1。

【技术特征摘要】
1.一种禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于：包括，单克隆抗体H5-M5、H7-M4和NP-M1。2.如权利要求1所述的禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于：还包括，AIV-H3N2的NP蛋白、AIV-H5N1的HA蛋白、AIV-H7N9的HA蛋白，和/或其包被的蛋白芯片反应板。3.如权利要求1或2所述的禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于：还包括，IgG酶标抗体。4.如权利要求3所述的禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于：所述IgG酶标抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体。5.如权利要求1、2、4中任一项所述的禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于：还包括，洗涤液、阳性对照样品、阴性对照样品、化学发光底物。6.如权利要求5所述的禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于：所述洗涤液包括TBST洗涤液，所述TBST洗涤液是包括含Tween-20的TBS，pH为7～7.5。7.如权利要求5所述的禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照样品为抗AIV-H5及AIV-H7的混合鸡血清，所述阴性对照样品为阴性鸡血清。8.权利要求1～7中任一项所述的禽流感H5、H...

【专利技术属性】
技术研发人员：周继勇，闫丽萍，肖倩，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32