一种登革病毒NS1抗原检测试纸条、试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种登革病毒NS1抗原检测试纸条、试剂盒及其制备方法，涉及登革病毒检测技术领域。本发明专利技术公开的登革病毒NS1抗原检测试纸条，包括依次贴于聚氯乙烯底部上的样品垫、包被了标记有胶体金的抗登革病毒NS1单克隆抗体的免疫结合垫、包被了抗登革病毒NS1单克隆抗体的检测线T和羊抗鼠IgG多抗的质控线C的硝酸纤维素膜和吸水纸；该试纸条可通过检测标记物的方法检测待检样品中是否存在登革病毒NS1抗原；该试纸条和包括有该试纸条的检测卡可特异快速地进行登革病毒早期感染的检测与诊断，减低成本，快速检测，有效满足临床使用的需要。

A test strip, kit and preparation method for dengue virus NS1 antigen detection

【技术实现步骤摘要】
一种登革病毒NS1抗原检测试纸条、试剂盒及其制备方法
：本专利技术属于体外诊断
，具体涉及生物检测
，特别涉及一种登革病毒NS1抗原检测试剂盒的制备方法。
技术介绍
：登革热是由登革热病毒引起的一种急性传染病，以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介，具有传播迅猛、发病率高、人群普遍易感、重症类型死亡率高等特点，被认为是全球最受关注的传染病。目前在非洲、美洲、东地中海、东南亚和西太平洋100多个国家呈地方性流行，东南亚和西太平洋地区受DV(登革病毒)影响更为严重。大约2.5亿人生活在登革热流行国家，感染DV后可发生登革热、登革出血热(DHF)或登革休克综合征(DSS)。每年估计有5000万以上的登革热感染发生，其中50万人因患登革热需住院治疗，感染者中约2.5％发生死亡。在我国，登革热具有典型的输入性和突发性，在发生时常常表现为较大范围、较严重的暴发流行等特点。按照《中华人民共和国传染病防治法》的规定为乙类传染病。近年来，登革热在我国本地暴发流行区域主要集中在广东、云南、浙江、广西、福建省(自治区)等东南沿海和边境省份，而输入病例在我国多数省份有分布。2014年我国登革热爆发时病例的发生数量超过45000例。登革病毒有四个血清型，在一个地区往往存在不同血清型病毒的交替流行，这更增加了登革出血热和登革休克综合征发生的可能性。登革出血热和登革休克综合征的病死率较高，不仅严重影响人民的身体健康，增加医疗负担，而且严重影响居民生活和旅游业的发展，进而影响当地的经济发展，同时由于控制不当还会造成大量的杀虫剂浪费，导致环境污染，严重影响人类和环境健康，也能诱发媒介生物抗药性。登革热的检测对象为媒介标本(伊蚊成蚊和幼虫)、疑似和临床诊断病例(按照登革热诊断标准WS216-2008)。媒介标本检测分为核酸检测和病毒分离两种方法。疑似和临床诊断病例检测，包括病原学检测和血清学检测。由于目前尚无特效的抗病毒治疗药物，主要采取支持及对症治疗措施。治疗原则是早发现、早诊断、早治疗、早防蚊隔离。而目前，市面上缺乏针对登革病毒检测的试剂盒。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种登革病毒NS1抗原检测试纸条和包括该试纸条的检测卡。该登革病毒NS1抗原检测试纸条和检测卡可特异快速地进行登革病毒早期感染的检测与诊断，减低成本，检测速度快。本专利技术的另一目的在于提供上述登革病毒NS1抗原检测试纸条和包括该试纸条的检测卡的制备方法。该制备方法得到的登革病毒NS1抗原检测试纸条和检测卡应用简便，结果准确，为下一步准确治疗由登革病毒引起的疾病提供了依据，适于大规模推广应用。本专利技术的另一目的在于提供含有上述登革病毒NS1抗原检测卡的试剂盒。该试剂盒可特异快速地进行登革病毒早期感染的检测与诊断，减低成本，快速检测，有效满足临床使用的需要。为实现上述目的，本专利技术提供了一种登革病毒NS1抗原检测试纸条的制备方法采用了如下的技术方案：a.用氯化金溶液和柠檬酸三钠溶液制备胶体金溶液；b.碳酸钾调节步骤a得到的胶体金溶液的pH至6.5-8.0，依次加入NS1mAb5、牛血清白蛋白溶液，离心得到沉淀，重悬液重悬沉淀得到胶体金标记的NS1mAb5溶液；c.用结合垫处理液均匀喷涂在结合垫上进行预处理，预处理结束后用步骤b得到的胶体金标记的NS1mAb5溶液对结合垫喷金得到免疫结合垫，划膜结束后将免疫结合垫置于室温，湿度≤30％条件下干燥1小时；d.用包被缓冲液稀释NS1mAb6得到检测线工作液；用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG多抗得到质控线工作液；用检测线工作液和质控线工作液分别在贴于聚氯乙烯底板的硝酸纤维素膜上划线，划膜结束后将膜置于37℃干燥箱中干燥24小时；e.用样品垫处理液均匀喷涂在样品垫上进行预处理；f将样品垫和免疫结合垫贴于划膜的硝酸纤维素膜下方，将吸水纸贴于划膜的硝酸纤维素膜的上方得到登革病毒NS1抗原检测试纸条。优选地，上述技术方案中，胶体金标记用的抗登革病毒NS1单克隆抗体为NS1mAb5，硝酸纤维素膜包被用的抗登革病毒NS1单克隆抗体为NS1mAb6。优选地，上述技术方案中，步骤a所述的具体制备步骤为称取990g水于三角烧瓶中，加入10ml浓度为2％的氯化金溶液，即溶液中氯化金的终浓度为0.02％，将烧瓶置于磁力搅拌器上加热至沸腾，迅速加入13ml浓度为2％的柠檬酸三钠溶液，待溶液变为红棕色后继续加热沸腾5分钟，静置至恢复室温，置于4℃保存待用。优选地，上述技术方案中，步骤b所述的具体步骤是将胶体金溶液中加入0.2M碳酸钾，混匀调节pH至6.5-8.0，然后加入NS1mAb5，继续搅拌30min，再加入2ml10％牛血清白蛋白溶液，继续搅拌30min，在4℃、转速为8000g的条件下离心30min得到沉淀，沉淀用1ml重悬液复溶优选地，上述技术方案中，步骤b所述重悬液为0.01M磷酸盐缓冲液，每100ml磷酸盐缓冲液包含lg牛血清白蛋白和10g海藻糖、0.05％NaN3，pH7.0±0.1。优选地，上述技术方案中，步骤c所述的免疫结合垫采用玻璃纤维膜或聚酯纤维膜。优选地，上述技术方案中，步骤c所述结合垫处理液为硼酸-硼砂缓冲体系，每100ml结合垫处理液含0.9g硼酸、0.6g四硼酸钠、5g海藻糖、0.5gBSA、10mg阻断剂、0.2％TritonX-100、0.05％NaN3，pH8.6±0.1。优选地，上述技术方案中，步骤d中，所述的包被缓冲液为Tris缓冲体系，每100ml包被缓冲液含1.2lgTris、0.5g氯化钠、3g蔗糖、0.05％NaN3，pH8.6±0.1。优选地，上述技术方案中，步骤d中所述检测线工作液浓度为1.0mg/mL；所述质控线工作液浓度为1.5mg/ml。优选地，上述技术方案中，步骤e中所述样品垫采用玻璃纤维膜或聚酯纤维膜。优选地，上述技术方案中，步骤e中所述样品垫处理液为Tris缓冲体系，每100ml样品垫缓冲溶液中含1.2lgTris、0.4g酪蛋白钠、1％Tween80、0.05％NaN3，pH8.6±0.1。本专利技术提供了一种登革病毒NS1抗原检测卡，其制备方法为：将上述获得的登革病毒NS1抗原检测试纸条置入塑料外壳中，其中，塑料外壳的加样孔在样品垫上方，塑料外壳的观察窗在检测线T和质控线C上方，加样孔和观察窗上方无遮挡物。本专利技术提供了一种登革病毒NS1抗原检测试剂盒，其制备方法为：将上述获得的登革病毒NS1抗原检测卡装入铝箔袋，与采样吸管、说明书装盒组成登革病毒NS1抗原检测试剂盒。一种登革病毒NS1抗原检测试纸条，试纸条自上而下依次由样品垫、免疫结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴于聚氯乙烯底板上组成，其中，所述免疫结合垫上包被胶体金标记的NS1mAb5，硝酸纤维素膜设有检测线T和质控线C，检测线T包被了NS1mAb6，质控线包被了羊抗鼠IgG多抗。一种登革病毒NS1抗原检测卡，包括装有上述试纸条的塑料外壳，其中塑料外壳的卡壳上盖上设有加样孔和观察窗，加样孔在样品垫上方，观察窗在检测线T和质控线C上方。一种登革病毒NS1抗原检测试剂盒，将装有上述检测卡的铝箔袋、采样吸管和说明书装盒得到试剂盒。本专利技术采用胶体金免疫层析原理，在结合垫上包被胶体金标记的NS1mAb5，在硝酸纤维素膜上分别包被NS1mAb本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种登革病毒NS1抗原检测试纸条的制备方法,其特征在于,包括以下步骤：a.用氯化金溶液和柠檬酸三钠溶液制备胶体金溶液；b.碳酸钾调节步骤a得到的胶体金溶液的pH至6.5‑8.0，依次加入抗登革病毒NS1单克隆抗体、牛血清白蛋白溶液，离心得到沉淀，重悬液重悬沉淀得到胶体金标记的抗登革病毒NS1单克隆抗体溶液；c. 用结合垫处理液均匀喷涂在结合垫上进行预处理，预处理结束后用步骤b得到的抗登革病毒NS1单克隆抗体标记的胶体金溶液对结合垫喷金得到免疫结合垫,划膜结束后将免疫结合垫置于室温，湿度≤30%条件下干燥1小时；d.用包被缓冲液稀释抗登革病毒NS1单克隆抗体得到检测线工作液；用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG多抗得到质控线工作液；用检测线工作液和质控线工作液分别在贴于聚氯乙烯底板的硝酸纤维素膜上划线，划膜结束后将膜置于37℃干燥箱中干燥24小时；e.用样品垫处理液均匀喷涂在样品垫上进行预处理；f.将样品垫和免疫结合垫贴于划膜的硝酸纤维素膜下方，将吸水纸贴于划膜的硝酸纤维素膜的上方得到登革病毒NS1抗原检测试纸条。

【技术特征摘要】
1.一种登革病毒NS1抗原检测试纸条的制备方法,其特征在于,包括以下步骤：a.用氯化金溶液和柠檬酸三钠溶液制备胶体金溶液；b.碳酸钾调节步骤a得到的胶体金溶液的pH至6.5-8.0，依次加入抗登革病毒NS1单克隆抗体、牛血清白蛋白溶液，离心得到沉淀，重悬液重悬沉淀得到胶体金标记的抗登革病毒NS1单克隆抗体溶液；c.用结合垫处理液均匀喷涂在结合垫上进行预处理，预处理结束后用步骤b得到的抗登革病毒NS1单克隆抗体标记的胶体金溶液对结合垫喷金得到免疫结合垫,划膜结束后将免疫结合垫置于室温，湿度≤30%条件下干燥1小时；d.用包被缓冲液稀释抗登革病毒NS1单克隆抗体得到检测线工作液；用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG多抗得到质控线工作液；用检测线工作液和质控线工作液分别在贴于聚氯乙烯底板的硝酸纤维素膜上划线，划膜结束后将膜置于37℃干燥箱中干燥24小时；e.用样品垫处理液均匀喷涂在样品垫上进行预处理；f.将样品垫和免疫结合垫贴于划膜的硝酸纤维素膜下方，将吸水纸贴于划膜的硝酸纤维素膜的上方得到登革病毒NS1抗原检测试纸条。2.根据权利要求1所述的登革病毒NS1抗原检测试纸条的制备方法，其特征在于：胶体金标记用的抗登革病毒NS1单克隆抗体为NS1mAb5，硝酸纤维素膜包被用的抗登革病毒NS1单克隆抗体为NS1mAb6。3.根据权利要求1所述的登革病毒NS1抗原检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤a所述的具体制备步骤为称取990g水于三角烧瓶中，加入10ml浓度为2%的氯化金溶液，即溶液中氯化金的终浓度为0.02%，将烧瓶置于磁力搅拌器上加热至沸腾，迅速加入13ml浓度为2%的柠檬酸三钠溶液，待溶液变为红棕色后继续加热沸腾5分钟，静置至恢复室温，置于4℃保存待用。4.根据权利要求1所述的登革病毒NS1抗原检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤b所述的具体步骤是将胶体金溶液中加入0.2M碳酸钾，混匀调节pH至6.5-8.0，然后加入NS1mAb5，继续搅拌30min，再加入2ml10%牛血清白蛋白溶液，继续搅拌30min，在4℃转速为8000g的条件下离心30min得到沉淀，沉淀用1ml重悬液复溶。5.根据权利要求1或3所述的登革病毒NS1抗原检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤b所述重悬液为0.01M磷酸盐缓冲液，每100ml磷酸盐缓冲液包含1g牛血清白蛋白和10g海藻糖、0.05%NaN3，pH7.0±0.1。6.根据权利要求1所述的登革病毒NS1抗原检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤c所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：童国权，杨标，金巍，刘中华，王国强，
申请(专利权)人：江苏硕世生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32