一种用于抗精神病药物用药指导的多重基因检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开了一种用于抗精神病药物用药指导的多重基因检测试剂盒及其使用方法。本发明专利技术采用多重PCR结合片段长短/质量分析方法，同步快速定性检测与抗精神病药物代谢、转运、靶点作用相关的CYP2D6、MC4R、CYP1A2、CYP3A5、EPM2A、和SLC6A2等6个基因上7个单核苷酸多态性(SNP)位点。检测步骤：(1)采集口腔脱落细胞保存于细胞采集卡，或采集血液样本并提取核酸；(2)采用步骤1所述细胞采集卡或核酸为模板进行多重PCR扩增；(3)按PCR产物片段长短/质量同步分离7个SNP位点、3个人类DNA内参基因及1个PCR反应内参的PCR产物；(4)结果分析判读。本发明专利技术的优势是快速、灵敏度高、重复性好、特异性强、通量高、成本低。

A Multiplex Gene Detection Kit for Antipsychotic Drug Guidance and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种用于抗精神病药物用药指导的多重基因检测试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及一种多重基因检测试剂盒，具体涉及一种用于抗精神病药物用药指导的多重基因检测试剂盒及其使用方法。
技术介绍
随着我国社会经济的快速发展和竞争压力的不断加大，精神疾病发病率逐年提高。我国精神疾病患病率约为17％。精神分裂症(schizophrenia)是最严重的精神疾病之一，世界各地人群中的发病率约为1％。精神分裂症具有多种复杂临床表现，以基本个性改变，思维、情感、行为之间不协调，精神活动与现实脱离为主要特征。精神分裂症不仅给患者本人及其家属带来极大的痛苦，而且也给家庭、医疗系统以及整个社会带来沉重的经济负担。精神分裂症的发病机制与脑内多巴胺(dopamine，DA)和5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)功能增强有关。目前抗精神病药物(antipsychoticagents)是治疗精神分裂症最主要的治疗手段，但是抗精神病药物的疗效存在巨大的个体差异。药物基因组研究显示，药物个体差异大的最主要原因是患者的基因多态性。在神经递质系统中有大范围的药物靶点，编码这些蛋白的DNA多态性可以改变神经递质和酶的功能与表达水平，以及药物受体和转运体的结合特点，从而使不同个体对药物的反应存在差异。人类基因组80％以上基因多态性都是单核苷酸多态性(SingleNucleotidepolymorphism，SNP)。SNP指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括碱基转换、颠换、缺失和插入。大部分抗精神病药物都经CYP2D6代谢。CYP2D6基因SNP位点发生突变可使酶活性发生变化，导致药物前体或中间活性产物浓度过高或过低，从而使患者疗效不佳，甚至发生严重毒副反应。与药物转运和药物靶点作用相关的SNP位点发生突变也对药物反应有重要影响。目前，神经精神药理学药物监测治疗共识指南(2017)和pharmGKB数据库已公布了部分抗精神病药物的代谢、转运和靶点基因。通过对药物代谢、转运和靶点相关的SNP位点进行检测，可判断患者对不同药物的反应，为患者量身定制一套用药方案，提高治疗效率，减轻患者医疗负担和痛苦，节省大量医院及社会资源(见表1)。表1抗精神病药物用药相关基因目前市场上，SNP分型检测技术主要有三种：测序法、荧光定量PCR法、基因芯片法。(1)荧光定量PCR法荧光定量PCR采用荧光淬灭及双末端标记技术，针对SNP位点设计特异性的探针，具有灵敏度高、准确性高和特异性高等优势。但荧光定量PCR通量低，若要同时检测多个个SNP位点，需要分管检测，操作复杂，样品用量大，难以适应临床需求。此外，荧光定量PCR难以设置内参质控，无法避免假阳性和假阴性。(2)基因芯片法基因芯片是通过微加工技术，将数以万计的特定序列的DNA片段(基因探针)有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。其优点是通量高、操作简便；缺点是检测成本昂贵、重复性差、灵敏度较低。芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准也限制了基因芯片技术的普及。(3)测序法Sanger测序法是SNP分型金标准，不仅能检测已知SNP，也能发现未知SNP。但Sanger测序法操作复杂，成本较高。当测序位点较多时需要逐个位点测序，耗时长，累计价格相对昂贵。二代测序技术实现了边合成边测序，具有高通量、高效率的优势，然而二代测序平台价格昂贵、普及度低，作为SNP检测技术在临床上的应用还不够成熟。由于与抗精神病药物用药指导相关的基因SNP数量较多，以上技术均具有明显局限性，因此很难应用于抗精神病药物用药指导的多重基因检测。目前，国内尚无有关以多重PCR和CE分离技术为基础的抗精神病药物用药指导的多重基因检测方案的报道。
技术实现思路
本专利技术提供了一种快速、灵敏度高、重复性好、准确性高、特异性强、通量高、成本低的抗精神病药物用药指导的多重基因检测试剂盒及其使用方法。其特征在于，使用多重PCR结合片段长短/质量分析方法，在一个反应管中同步快速定性检测与抗精神病药物用药相关的7个单核苷酸多态性(SNP)位点。本试剂盒在检测上述7个SNP位点的PCR反应系统中加入了3个人基因组DNA(huDNA)内参和1个PCR反应内参(如表2所示)，同步进行PCR扩增，用于监测核酸提取及PCR反应过程，可避免假阴性和假阳性。表2抗精神病药物用药指导的多重基因检测试剂盒检测位点和引物本试剂盒包括以下组分：引物组合物SchPrimerMix、PCR反应液和阳性对照品、超纯水。阳性对照品，内含上述7个SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物，用于SNP检测系统测试及每次引物订购后的质量控制。PCR反应液包括以下组分：超纯水、2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP。使用本试剂盒检测步骤如下：(1)采集口腔脱落细胞保存于细胞采集卡，或采集血液样本并提取核酸。其中，保存于细胞采集卡上的口腔脱落细胞，可不需进行核酸提取，直接用于PCR扩增，节省了核酸提取的时间；(2)以细胞采集卡或提取的核酸为模板进行多重PCR扩增。PCR反应条件为：95℃5min；94℃10s，61℃1min；70℃30s，循环29次；60℃，3min；4℃直至收取PCR产物；(3)按PCR产物片段长短/质量同步分离7个SNP位点及4个内参。本专利技术采用毛细电泳分离PCR产物：在96孔样品板中配制电泳样品，取高纯甲酰胺8.7μL，标准品SIZE-5000.3μL，PCR产物1μL，混匀离心。将配制好的电泳样品置于3500基因分析仪中，按操作说明进行毛细电泳；(4)根据所设计的每个检测位点的片段长度进行结果分析。根据检测峰图，可获得每个SNP位点的基因型，结合各个基因对应的临床参考信息(表3.1～3.6)，判断患者对各种抗精神病药物的反应，从而指导抗精神病药物的个性化使用。表3.1CYP2D6基因对应的临床参考信息a.*5位点的突变类型为基因缺失突变。DW代表至少一条染色体未发生缺失突变；DD代表两条染色体都发生缺失突变。表3.2CYP1A2基因对应的临床参考信息表3.3CYP3A5基因对应的临床参考信息表3.4EPM2A基因对应的临床参考信息表3.5MC4R基因对应的临床参考信息表3.6SLC6A2基因对应的临床参考信息与现有技术相比，本专利技术具有以下优势：本专利技术基于3500基因分析仪创立了一种用同步检测与抗精神病药物用药相关的4个基因上7个SNP位点的检测方案；特异性和准确度可达到qPCR水平；可在短时间内(2.5小时)同时完成多个样品7个SNP位点的检测；DNA内参和反应内参的使用可监测DNA提取及PCR反应的效率，避免了假阴性和假阳性。综上所述，本专利技术提供了一种同步检测与抗精神病药物用药相关的4个基因上7个SNP位点的检测方案，具有快速、灵敏度高、重复性好、特异性强、通量高、成本低等优势。附图说明图1一个精神分裂症患者的口腔脱落细胞采集卡样本(未经核酸提取，直接进行PCR)的检测结果；图2为一个精神分裂症患者的全血样本的检测结果。具体实施方式为了更好地理解本专利技术的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于抗精神病药物用药指导的多重基因检测试剂盒，其特征在于，包括如下表所示的同步快速定性检测与抗精神病药物用药相关的7个SNP位点和4个内参基因的引物组合物：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.29、PCR反应液、阳性对照品和超纯水；所述7个SNP位点为：CYP2D6基因的*5和*10位点，CYP1A2基因的rs762551位点，CYP3A5基因的rs776746位点，EPM2A基因的rs1415744位点，MC4R基因的rs489693位点，SLC6A2基因的rs5569位点；

【技术特征摘要】
1.一种用于抗精神病药物用药指导的多重基因检测试剂盒，其特征在于，包括如下表所示的同步快速定性检测与抗精神病药物用药相关的7个SNP位点和4个内参基因的引物组合物：SEQIDNO.1～SEQIDNO.29、PCR反应液、阳性对照品和超纯水；所述7个SNP位点为：CYP2D6基因的*5和*10位点，CYP1A2基因的rs762551位点，CYP3A5基因的rs776746位点，EPM2A基因的rs1415744位点，MC4R基因的rs489693位点，SLC6A2基因的rs5569位点；2.如权利要求1所述的一种用于抗精神病药物用药指导的多重基因检测试剂盒，其特征在于，所述7个SNP位点除CYP2D6*5位点外，针对每一个SNP位点设计了3条引物，其中野生型引物和突变型引物分别与野生型基因和突变型基因互补结合，1条共用的引物分别与野生型和突变型引物形成引物对，扩增出片段长度有2～10个碱基差异的PCR产物。3.如权利要求1所述的一种用于抗精神病药物用药指导的多重基因检测试剂盒，其特征在于，所述CYP2D6*5位点为特殊SNP位点，其突变型为缺失突变，对基因上游、基因内部和基因下游设计引物，通过片段大小判断*5位点是否发生缺失突变。4.如权利要求1所述的一种用于抗精神病药物用药指导的多重基因检...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕军英，陈真，王凡，吴勇，余丁，
申请(专利权)人：宁波海尔施基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33