一种艾本那肽前体中三乙胺残留的GC检测方法技术

本发明专利技术公开了一种艾本那肽前体中三乙胺残留的GC检测方法，它包括溶剂配制，样品制备，对三乙胺对照品溶液、系统适用性溶液及供试品溶液分别进行GC检测，检测条件为：6%氰丙基‑苯基‑甲基聚硅氧烷填充的色谱柱，柱温：35～45℃，载气：氮气，流速：2.5～3.5ml/min，检测器：FID。本发明专利技术可准确有效的对艾本那肽前体中三乙胺残留进行定量，本发明专利技术操作简便，检测成本低，灵敏度高，精确度高，准确可靠，三乙胺定量限为2ppm，远低于三乙胺限度1000ppm。检测结果能够满足检测质量结果判定，适用于实验室检测和企业产品质量控制，可用于艾本那肽前体中三乙胺残留的检测。

A GC method for the determination of triethylamine residues in the precursor of ebenatide

【技术实现步骤摘要】
一种艾本那肽前体中三乙胺残留的GC检测方法
本专利技术涉及艾本那肽前体中三乙胺残留的检测方法。
技术介绍
GLP-1是一种人体内存在的肽激素，通过环磷酸腺苷或其他细胞内信号传导机制与其他调节系统协同发挥作用，诱导胰岛素分泌、刺激胰岛素生物合成、抑制胰高血糖素分泌、延迟胃排空、并且减少摄食量，同时对胰腺产生滋养作用。作为GLP-1类似物，Exendin-4可通过GLP-1受体诱导产生与GLP-1类似的生理学作用，但比GLP-1更加强效，作用持续时间更长。艾本那肽前体是一种经过合成修饰的Exendin-4，通过与重组人血白蛋白相结合，避免了快速降解和快速肾清除，因此延长了作用持续时间，并具有与Exendin-4类似的生理作用和作用机制。在艾本那肽前体的纯化过程中，使用三乙胺作为流动相。三乙胺对发育有影响，具有生殖毒性，故需对艾本那肽前体中的三乙胺残留进行控制。由于艾本那肽前体使用三氟乙酸进行沉淀，造成艾本那肽前体的水溶液成酸性。三乙胺与三氟乙酸成盐，造成三乙胺无法准确检出。
技术实现思路
本专利技术提供一种仅通过普通的高效气相色谱仪便可实现艾本那肽前体中三乙胺残留检测的方法。为实现本专利技术目的，这种艾本那肽前体中三乙胺残留的GC检测方法其特征在于包括以下步骤：a.溶液制备①对照品贮备溶液：将三乙胺加入0.08M～0.1M氢氧化钠水溶液制得浓度为9～11mg/ml的三乙胺对照品贮备溶液，备用；②对照品溶液：取三乙胺对照品贮备溶液加入0.08M～0.1M氢氧化钠水溶液制得浓度为0.9～1.1mg/ml的三乙胺对照品溶液，备用；③系统适用性溶液：在艾本那肽前体0.1g中加入5ml三乙胺对照品溶液溶解后摇匀，备用；④供试品溶液：在艾本那肽前体0.1g中加入0.08M～0.1M的氢氧化钠水溶液5ml溶解后摇匀，备用；b.GC检测色谱条件色谱柱：采用6%氰丙基-苯基-甲基聚硅氧烷为填充剂的色谱柱；内径为0.20～0.53mm，柱长25～75m，膜厚1.12～3μm；柱温：35～45℃；载气：氮气；流速：2.5～3.5ml/min；检测器：FID；进样口温度：120～180℃；分流比：20:1～30:1；检测器温度240℃～280℃；顶空条件：顶空平衡温度75℃～85℃；顶空平衡时间：25～35min；升温程序：40℃保持6～10min后以10～20℃/min升温至100℃，保持1～3min后再以20～40℃/min升温℃，升温至180℃后保持1～3min；最后以30℃/min升至240℃,维持7～9min；c.对空白溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液进行气相色谱仪检测。本专利技术色谱条件的选择1、色谱柱的选择本专利技术分别选择HP-5、DB-624、HP-50三种气相色谱柱，用HP-5色谱柱时检测时间55分钟，用HP-50色谱柱时色谱峰分叉。通过比较，用6%氰丙基-苯基-甲基聚硅氧烷为填充剂的色谱柱效果最好，三乙胺的拖尾因子、准确度及耐用性等最佳。2、柱温的选择选择6%氰丙基-苯基-甲基聚硅氧烷为填充剂的色谱柱进行三乙胺检测最佳温度使用范围35～180℃。3、顶空平衡温度的选择本专利技术使用的溶剂为0.08M～0.1M氢氧化钠水溶液，顶空平衡温度最佳温度使用范围为75℃～85℃。本专利技术方法学的建立1、专属性试验将0.08M～0.1M氢氧化钠水溶液空白溶剂、系统适用性溶液分别顶空加热后，依次注入气相色谱仪，记录色谱图，谱图显示溶剂对检测无干扰，三乙胺与相邻杂质间的分离度大于1.5。2、线性范围精密量取三乙胺对照储备液各1、2.5、4、5、6、7.5ml，分别置于6个50ml容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀后各精密量取5ml，分别置于20ml顶空瓶中，压盖，顶空加热后注入气相色谱仪，记录色谱图。以峰面积（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标进行线性回归，回归方程A=54561C−1372.6，r2=0.9982（n=6），结果表明三乙胺在0.2048～1.5362mg/ml范围内具有良好的线性关系。3、耐用性试验3.1不同色谱柱选择三根不同批号的色谱柱进行系统适用性试验并对艾本那肽前体进行测定，系统适用性试验均符合要求，三乙胺测定结果一致，结果见表1，从考察结果可知，不同批号的色谱柱均满足测定要求。表1艾本那肽前体中三乙胺含量测定不同色谱柱考察结果DB-624色谱柱为美国Agilent公司产品，填充剂为6%氰丙基-苯基-甲基聚硅氧烷。3.2不同色谱条件考察适当改变艾本那肽前体中三乙胺含量测定时的色谱条件，进行系统适用性试验并对艾本那肽前体进行测定，系统适用性试验均符合要求，三乙胺测定结果一致，确认的色谱条件的耐用性范围及三乙胺测定结果见表2、表3。表2三乙胺检查色谱条件的耐用性表3艾本那肽前体中三乙胺不同色谱条件的测定结果4、准确度取供试品艾本那肽前体0.1g，精密称定后，置于20ml顶空瓶中，精密加入5ml对照溶液溶解后，压盖，摇匀。平行制备6份，分别顶空加热，注入气相色谱仪，记录色谱图。计算三乙胺的回收率，三乙胺回收率范围是94.31～100.24%，回收率RSD（n=6）2.08%，结果见表4。表4准确度结果5、定量限取三乙胺对照品贮备液适量，加入0.08M～0.1M的氢氧化钠水溶液稀释到2ppm的浓度后，精密量取5ml，置于20ml顶空瓶中压盖，摇匀。顶空加热，注入气相色谱仪，记录色谱图，此时信噪比S/N为1626，峰面积RSD%（n=6）为5.2%。此时进样浓度2ppm（相当于主成分艾本那肽前体质量含量的0.01%），满足三乙胺检测要求。结果显示，采用6%氰丙基-苯基-甲基聚硅氧烷为填充剂的气相色谱柱按上述条件测定艾本那肽前体中三乙胺的含量，经验证方法准确可行。本专利技术具有以下有益效果：（1）加入氢氧化钠使供试品溶液略显碱性，可满足检测要求，样品检测时间短，单针样品运行时间约26min，操作简便可靠，对色谱柱及仪器要求低，既适用于实验室的检测，更适用于企业大规模生产的产品质量控制，对于产品中控等能较快得到检测结果。（2）本专利技术方法专属性强，准确度回收率在94.31%～100.24%之间，线性系数r2为0.9982，可准确测定酸性样品中三乙胺含量。（3）本专利技术方法定量限为2ppm，检测更灵敏，且远低于限度值，可有效的检测艾本那肽前体中三乙胺残留量，可应用于需要进行酸性样品中三乙胺残留检测的产品。附图说明图1为本专利技术检测艾本那肽前体中三乙胺的空白溶剂色图谱。图2为本专利技术检测艾本那肽前体中三乙胺的系统适用性溶液色图谱。图3为本专利技术检测艾本那肽前体中三乙胺的对照品溶液色谱图。图4为本专利技术检测艾本那肽前体中三乙胺的供试品溶液色谱图。具体实施方式以下实施例有助于本专利技术的了解，但这些实施例仅为了对本专利技术加以说明，本专利技术并不限于这些内容。实施例1：艾本那肽前体中三乙胺含量的测定包括以下步骤：a.溶液制备①对照品贮备溶液：取三乙胺约1g至100ml容量瓶中加入0.08M的氢氧化钠水溶液制得浓度为9～11mg/ml的三乙胺对照品贮备溶液，备用；②对照品溶液：取上述三乙胺对照品储备溶液10ml至100ml容量瓶中加入0.08M的氢氧化钠水溶液，定容，摇匀，制得浓度为0.9～1.1mg/ml的三乙胺对照品溶液，备用；③系统适用性溶液：取艾本那本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种艾本那肽前体中三乙胺残留的GC检测方法，其特征在于包括以下步骤：溶液制备①对照品贮备溶液：将三乙胺加入0.08M～0.1M氢氧化钠水溶液制得浓度为9～11mg/ml的三乙胺对照品贮备溶液，备用；②对照品溶液：取三乙胺对照品贮备溶液加入0.08M～0.1M氢氧化钠水溶液制得浓度为0.9～1.1mg /ml的三乙胺对照品溶液，备用；③系统适用性溶液：在艾本那肽前体0.1g中加入5ml三乙胺对照品溶液溶解后摇匀，备用；④供试品溶液：在艾本那肽前体0.1g中加入0.08M～0.1M的氢氧化钠水溶液5ml溶解后摇匀，备用；b. GC检测色谱条件色谱柱：采用6%氰丙基‑苯基‑甲基聚硅氧烷为填充剂的色谱柱；内径为0.20～0.53mm，柱长25～75m，膜厚1.12～3μm；柱温：35～45℃；载气：氮气；流速：2.5～3.5ml/min；检测器：FID；进样口温度：120～180℃；分流比：20:1～30:1；检测器温度240℃～280℃；顶空条件：顶空平衡温度75℃～85℃；顶空平衡时间：25～35min；升温程序：40℃保持6～10min后以10～20℃/min升温至100℃，保持1～3min后再以20～40℃/min升温℃，升温至180℃后保持1～3min；最后以30℃/min升至240℃, 维持7～9min；c. 对空白溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液进行气相色谱仪检测。...

【技术特征摘要】
1.一种艾本那肽前体中三乙胺残留的GC检测方法，其特征在于包括以下步骤：溶液制备①对照品贮备溶液：将三乙胺加入0.08M～0.1M氢氧化钠水溶液制得浓度为9～11mg/ml的三乙胺对照品贮备溶液，备用；②对照品溶液：取三乙胺对照品贮备溶液加入0.08M～0.1M氢氧化钠水溶液制得浓度为0.9～1.1mg/ml的三乙胺对照品溶液，备用；③系统适用性溶液：在艾本那肽前体0.1g中加入5ml三乙胺对照品溶液溶解后摇匀，备用；④供试品溶液：在艾本那肽前体0.1g中加入0.08M～0.1M的氢氧化钠水溶液5ml溶解后摇匀，备用；b.GC检测色谱条件色谱柱：采用6%氰丙基-苯基-甲基聚硅氧烷为填充剂的色...

【专利技术属性】
技术研发人员：李云峰，郭静，刘岩涛，曹学婷，白茜茜，刘晓霞，刘云仙，胡丽英，
申请(专利权)人：河北常山生化药业股份有限公司，常山凯捷健生物药物研发河北有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13