【技术实现步骤摘要】
构建细胞全转录本扩增产物的方法及其应用
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及构建细胞全转录本扩增产物的方法及其应用，更具体地，本专利技术涉及构建细胞全转录本扩增产物的方法、检测细胞中预定因子的方法、检测细胞中预定因子的系统以及检测前列腺癌循环肿瘤细胞中AR-V7的试剂盒。
技术介绍
前列腺癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内其发病率居男性恶性肿瘤的第2位，死亡率居第5位。近十年来，随着我国人口老龄化和生活方式的改变，前列腺癌的发病率和死亡率呈明显的逐年上升趋势。雄激素受体(AR)在前列腺癌的发生、发展中起着重要作用，其通过调节下游基因的表达，促进前列腺癌的进展和转移。晚期前列腺癌的治疗方法主要是内分泌治疗，即雄激素剥夺治疗(ADT)。但在前列腺癌的治疗过程中，常常对其产生耐药，并发展成为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。在CRPC中尽管雄激素水平被抑制，但AR信号通路在CRPC中仍起着至关重要的作用。AR-V7(androgenreceptorsplicevariant7)是AR-Vs(androgenreceptorsplicevarian...
【技术保护点】
1.一种构建细胞全转录本扩增产物的方法，其特征在于，包括：将细胞样品进行磁珠捕获处理，以便获得待处理细胞；以及将所述待处理细胞进行单细胞全转录本扩增，以便获得所述待处理细胞的全转录本扩增产物，其中，进行单细胞全转录本扩增之前，进一步包括将所述待处理细胞进行裂解处理，所述裂解处理是通过向所述待处理细胞中加入PBS和裂解液进行的，基于1～100个待处理细胞，所述PBS的用量为7微升，所述裂解液的用量为4微升，所述裂解液包括100mM Tris‑HCl、500mM KCl、25mM MgCl2、10％NP40、0.1M DTT、40U/μl的RNA酶抑制剂、0.5μM UP1引物...
【技术特征摘要】
1.一种构建细胞全转录本扩增产物的方法，其特征在于，包括：将细胞样品进行磁珠捕获处理，以便获得待处理细胞；以及将所述待处理细胞进行单细胞全转录本扩增，以便获得所述待处理细胞的全转录本扩增产物，其中，进行单细胞全转录本扩增之前，进一步包括将所述待处理细胞进行裂解处理，所述裂解处理是通过向所述待处理细胞中加入PBS和裂解液进行的，基于1～100个待处理细胞，所述PBS的用量为7微升，所述裂解液的用量为4微升，所述裂解液包括100mMTris-HCl、500mMKCl、25mMMgCl2、10％NP40、0.1MDTT、40U/μl的RNA酶抑制剂、0.5μMUP1引物、2.5mMdNTP以及无核酸酶水。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞样品来源于外周血；任选地，所述外周血为肿瘤患者外周血；任选地，所述待处理细胞为循环肿瘤细胞；任选地，所述裂解处理包括用移液器对所述待处理细胞进行吸打重悬处理至少5次。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述磁珠捕获处理是通过如下方式进行的：1)将5mL外周血与100μL磁珠进行第一混合，所述磁珠预先利用PBS进行第一重悬处理，所述第一混合是在5rpm的条件下进行30min；2)将所述第一混合产物在磁力架上静置3min，以便除去第一上清；3)将步骤2)所得沉淀进行第二重悬处理，所述第二重悬处理是在5mlPBS中进行的；4)将第二重悬处理产物在磁力架上静置1min，以便除去第二上清；5)重复步骤3)和4)两次；6)将步骤5)所得沉淀进行第三重悬处理，所述第三重悬处理是在1mlPBS中进行的；7)将第三重悬处理产物在磁力架上静置1分钟，以便获得所述循环肿瘤细胞；其中，所述磁珠包被有识别所述循环肿瘤细胞的抗体；任选地，所述抗体包括EpCAM、Her2的至少之一。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述单细胞全转录本扩增是通过如下方式获得的：1)将循环肿瘤细胞在24℃的条件下进行裂解5分钟，随后在95℃的条件下裂解3分钟，冷却至4℃；2)将步骤1)获得的裂解产物在磁力架上静置1分钟，吸取第三上清；3)将步骤2)所获得第三上清与2μlgDNAWipeoutBuffer进行混合，所述混合是在42℃的条件下进行10分钟；4)将步骤3)所获得产物与6μlQuantiscriptRTmix进行混合，所述混合是在42℃的条件下进行60分钟；5)将步骤4)所得产物在95℃的条件下孵育3分钟，放冰上冷置；6)在步骤5)所得产物与10μl的ligationmix混合，所述混合是在24℃条件下进行30分钟；7)将步骤6)所得产物在...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭琦，王秀莉，董超，李长平，卢孟孟，宋廷瑞，
申请(专利权)人：杭州莲和医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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