高速逆流色谱仪在糖苷类成分生物转化中的应用制造技术

本发明专利技术涉及糖苷转化技术领域，具体涉及高速逆流色谱仪在糖苷类成分生物转化中的应用。本发明专利技术将高速逆流色谱仪作为糖苷类成分进行生物酶转化反应的反应器，利用糖苷及苷元在两相溶剂之间的分配差异，预先将糖苷水解酶加入水相溶液中作为固定相，将待转化的糖苷底物加入流动相中。逆流色谱运转时，酶位于固定相中，由于底物糖苷更易溶于水溶液，在流动过程中会从流动相进入固定相与糖苷水解酶发生充分酶解反应生成小分子苷元，生成的苷元随流动相流出，完成生物转化及分离过程。本发明专利技术将高速逆流色谱仪作为生物转化反应器，能够一次性完成转化及分离，并且能够消除酶解反应过程中的抑制效应，增加转化率，具有显著的技术效果及经济意义。

Application of High Speed Countercurrent Chromatography in Biotransformation of Glycosides

【技术实现步骤摘要】
高速逆流色谱仪在糖苷类成分生物转化中的应用
本专利技术涉及糖苷转化
，具体涉及高速逆流色谱仪作为酶解反应器将糖苷类物质生物转化为苷元的应用。
技术介绍
糖苷，又称配糖体，由弱极性的配基与强极性的糖基组成，其中非糖部分称为苷元。因而糖苷类化合物分子具有极性大、脂溶性差、分子质量大的特点，不易透过肠壁黏膜吸收。糖苷由于在肠内滞留时间较长，部分糖苷在肠道内特异菌群分泌的酶的作用下发生了转化，转化产物极性减小，脂溶性增加，更容易透过肠壁进入血液循环，进而发挥药效。例如，大豆异黄酮为大豆中的主要活性成分，具有降低乳腺癌发病率、改善性脑血管疾病的功效，而自然界中天然的大豆异黄酮主要为结合型葡糖苷的形式，需要在肠道菌群的代谢作用下转化为苷元后才能被机体吸收利用。京尼平苷是从栀子果中提取的一种环烯醚萜苷，其苷元为京尼平，具有良好的利胆作用。商陆中的主要成分商陆皂苷，其苷元为三萜皂苷，祛痰作用显著强于商陆皂苷。将天然植物中的成分经过体外生物转化得到活性更好的苷元，将有助于进一步明确苷类药物口服起效的机制，同时对指导开发以苷元为药效物质基础的高效制剂具有潜在的价值。生物转化法具有反应温和、专一性强以及环境污染小等优势，具有广阔的应用前景。常见的生物转化的反应器主要包括均相反应器、固定化酶反应器、酶膜反应器、陶瓷膜反应器等，具有反应量大，酶处理简单等优势，同时存在产物抑制现象严重、膜物理损伤严重、易污染、回收困难、清洗和更换麻烦等劣势。高速逆流色谱法于1982年由美国国立卫生院Ito博士研制开发的一种新型的、连续高效的液液分配色谱技术，依靠被分离物质在两相中分配系数K值的不同，实现样品的有效分离，可以达到几千个理论塔板数。高速逆流色谱能避免固相载体表面与样品发生反应而导致样品的污染、失活、变性和不可逆吸附等不良影响，已经在生物、医药、食品、材料、化妆品和环保等领域获得了广泛的应用。同时高速逆流色谱使用简单的螺旋空管，进料方式简单灵活，样品不需要严格的预处理，可处理带固体悬浮物的物料，这些优点使高速逆流色谱作为生物反应器潜力巨大。现有技术中通常向糖苷中加入酶完成生物转化反应后，再经高速逆流色谱将反应后的苷元分离，步骤较为繁琐，尚未公开将高速逆流色谱仪直接作为生物酶转化反应器的技术方案。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中的空白，针对常规生物反应器的劣势，本专利技术目的在于提供一种基于高速逆流色谱的生物转化方法，该方法适用于绝大多数糖苷类物质的转化，具有操作方便、转化率高，可直接得到高纯度苷元。本专利技术将高速逆流色谱仪作为酶解反应的反应器，基于逆流色谱的工作方式，为糖苷与酶的反应提供了新的反应形式。由于多数的糖苷及酶更易溶于水溶液，本专利技术预先将糖苷水解酶加入水相溶液中作为固定相，将待转化的糖苷底物加入流动相中。逆流色谱运转时，酶位于固定相中，处于相对固定的状态，由于底物糖苷更易溶于水溶液，在流动过程中会从流动相进入固定相与糖苷水解酶发生酶解反应生成小分子苷元，苷元往往极性较小、更易溶于有机相溶液，生成的苷元回到流动相中，完成生物转化及分离过程。针对上述生物转化形式，本专利技术中的两性溶剂体系依据糖苷及苷元的溶解性进行确定，其中固定相为更易溶解酶和糖苷的水相溶液，可以是加入了缓冲盐的水溶液，该缓冲盐溶液的设置是为了保持酶的活性、提供相应的离子浓度及pH值。流动相选择与固定相不互溶的有机溶液，生成的苷元在该有机溶液中的溶解度大于在固定相中的溶解度，促使生成的苷元能够随流动相一同流出。确定两相溶剂体系后，对酶进行酶活力测试，测定该溶剂体系下酶解效率最佳的酶或酶组合。为了实现以上技术目的，本专利技术技术方案如下：本专利技术第一方面，提供一种基于高速逆流色谱的糖苷转化方法，该转化方法包括以下步骤：(1)配制适合逆流色谱两相溶剂系统，即流动相与固定相；其中，糖苷水解酶加入固定相中，糖苷底物加入流动相中；(2)将加入酶的固定相溶液泵入高速逆流色谱仪，设置仪器参数，泵入空白流动相达到流体动力学平衡；(3)将加入底物的流动相以一定流速泵入逆流色谱仪进行酶解反应，出口端收集产物溶液；(4)将步骤(3)中得到的产物溶液浓缩，烘箱干燥，即得苷元。优选的，上述逆流色谱的两相溶剂为水相溶液及与其不互溶的有机相溶液，其中水相溶液作为固定相，有机相溶液作为流动相。糖苷底物在水相溶液中的分配系数大于在有机相中的分配系数，生成的苷元在有机相中的分配系数大于在水相中的分配系数，糖苷底物在水相溶液中的分配系数应当大于苷元在水相溶液中的分配系数。进一步优选的，通过HPLC法测定糖苷底物和苷元在逆流色谱两相溶剂系统中的分配系数(KD)值，具体步骤如下：按溶剂系统的比例，配制一定体积溶剂，充分振摇，静置分层。先取部分水相于试管中，加入等量的底物和产物，HPLC测定水相中各目标峰的峰面积，记为A1，再加入等体积有机相，充分振摇，静置分层，再测定水相中目标峰的峰面积，记为A2。样品在两相溶液的分配系数按如下公式计算：KD＝(A1-A2)/A2。通过计算，选择底物KD大于产物KD的溶剂体系。进一步优选的，其中水相溶液为两相系统的下相，有机相溶液为两相系统的上相。现有技术中，为了实现良好的分离效果，一般将质地更轻的上相溶液作为固定相，以确保分离过程中能够具有良好的固定相保留率。而本专利技术的方案中，采用下相作为固定相，为了保证一定的固定相保留率，操作难度更大。更进一步优选的，上述有机相溶液为乙酸乙酯、正己烷为主要成分的有机溶液，水相溶液为含有缓冲盐的水溶液，具有适宜上述糖苷水解酶存活浓度和pH值。优选的，上述配置好的两相溶液在泵入逆流色谱仪之前需放置于水浴锅中保温待用，水浴锅的温度为35-45℃。具体的，为40℃。优选的，该糖苷水解酶的设置依据底物中糖苷键的类型及酶在溶剂体系中的活力进行选择，可以是α-甘露糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、β-木糖苷酶、壳三糖苷酶、硫代糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、蜗牛酶、纤维素酶、柚苷酶、果胶酶中的一种或几种的混合。优选的，上述转化方法中，逆流色谱采用正转反接或反转正接模式；更优选的，采用正转反接模式。本专利技术研究表明，正转反接和反转正接两种模式下均具有较高的固定相保留率，可达到80％以上，适合于作为逆流色谱反应器的洗脱模式。优选的，逆流色谱仪的转速为750-1000rpm/min；更优选的，为800-850rpm/min。优选的，步骤(3)中加入了底物的流动相溶液以20-40mL/min的流速泵入逆流色谱仪。本领域公知，逆流色谱仪工作时需要保证良好的固定相保留率，当流动相流速相对慢时，不利于固定相的保留，使酶解反应无法进行，而流动相流动相流速过快时，则不利于流动相中的糖苷进行固定相与酶进行充分的反应。因此，固定相和流动相的流速应当处于一个相对的有效范围，既能够实现良好的固定相保留率，又能够使底物与酶发生充分的酶解反应。优选的，步骤(3)中逆流色谱仪按FED-OUT模式运行。优选的，当糖苷底物为染料木苷时，其苷元为染料木素，采用的两相溶剂体系为乙酸乙酯/缓冲溶液(1：1，v/v)体系。进一步优选的，该乙酸乙酯/缓冲溶液(1：1，v/v)体系的配制方法如下：将乙酸乙酯/缓冲溶液(1：1，v/v)溶剂系统按照比例置于分液漏斗中，充分震荡，静置分层，待两相达到平衡，分别取上、下相本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于高速逆流色谱的糖苷转化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配制适合逆流色谱两相溶剂系统，即流动相与固定相；其中，糖苷水解酶加入固定相中，糖苷底物加入流动相中；(2)将加入酶的固定相溶液泵入高速逆流色谱仪，设置仪器参数，泵入空白流动相达到流体动力学平衡；(3)将加入糖苷底物的流动相以一定流速泵入逆流色谱仪进行酶解反应，出口端收集产物溶液；(4)将步骤(3)中得到的产物溶液浓缩，烘箱干燥，即得苷元。

【技术特征摘要】
1.一种基于高速逆流色谱的糖苷转化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配制适合逆流色谱两相溶剂系统，即流动相与固定相；其中，糖苷水解酶加入固定相中，糖苷底物加入流动相中；(2)将加入酶的固定相溶液泵入高速逆流色谱仪，设置仪器参数，泵入空白流动相达到流体动力学平衡；(3)将加入糖苷底物的流动相以一定流速泵入逆流色谱仪进行酶解反应，出口端收集产物溶液；(4)将步骤(3)中得到的产物溶液浓缩，烘箱干燥，即得苷元。2.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于，所述两相溶剂体系为水相溶剂及与其不互溶的有机相溶剂，所述水相溶剂作为固定相，糖苷底物在水相溶液中的分配系数大于在有机相中的分配系数，生成的苷元在有机相中的分配系数大于在水相中的分配系数，所述糖苷底物在水相溶剂中的分配系数大于苷元产物在水相溶剂中的分配系数；优选的，通过HPLC法测定糖苷底物与苷元在两相溶剂系统中的分配系数KD值；进一步优选的，所述分配系数KD值测定方法步骤如下：按溶剂系统的比例，配制一定体积溶剂，充分振摇，静置分层；先取部分水相于试管中，加入等量的底物和产物，HPLC测定水相中各目标峰的峰面积，记为A1，再加入等体积有机相，充分振摇，静置分层，再测定水相中目标峰的峰面积，记为A2；样品在两相溶液的分配系数按如下公式计算：KD＝(A1-A2)/A2。3.如权利要求2所述的转化方法，其特征在于，所述水...

【专利技术属性】
技术研发人员：王岱杰，王晓，耿岩玲，赵恒强，崔莉，闫慧娇，
申请(专利权)人：山东省分析测试中心，
类型：发明
国别省市：山东,37