一种重组酵母菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组酵母菌及其应用。所述的重组酵母菌表达番茄红素合成基因crtE、crtB和crtI，所述的基因crtE、crtB和crtI来源于戈壁奇球菌，各基因均置于生长偶联动态调控元件HSP26启动子之下，并以串联的形式整合于酿酒酵母基因组上；该重组酵母菌过表达限速步骤动态调控HMGR基因，且该HMGR基因置于生长偶联动态调控元件Cit1启动子之下、竞争性代谢途径ERG9启动子被生长偶联动态调控元件PDC1启动子替换、HMG1基因启动子及其调控区域被生长偶联动态调控元件Cit1启动子替换、Ald6基因被敲除。本发明专利技术的重组酵母菌可应用于类胡萝卜素的合成。

【技术实现步骤摘要】
一种重组酵母菌株及其应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种重组酵母菌株及其应用。
技术介绍
酿酒酵母作为公认安全微生物(GRAS)，在工业生产中已得到广泛的应用。作为模式真核系统，酿酒酵母拥有众多基因操作工具，代谢工程改造方便快捷；并且酿酒酵母对严苛的工业生产条件表现出高度的耐受性。所以，酿酒酵母常常是进行生物合成的首选宿主。在进行代谢工程改造时，多是通过静态控制系统过表达代谢途径中的关键酶。静态控制系统不仅会造成代谢流量过早地进入目标代谢途径，影响微生物细胞生长；还会造成代谢网络的不平衡，并且重要代谢产物会随着细胞生长状态的不同而产生变化，这就需要动态调控网络来提升细胞的生产性能。目前半乳糖诱导调控元件是酿酒酵母代谢途径构建过程中经常使用，并行之有效的系统，但这个系统需要半乳糖诱导，并且该诱导剂在发酵过程中会被消耗，需要及时补加，且价格比较昂贵，因此这种策略在工业生产中并不经济。为了解决这一问题，申请号为CN201610321188.9的中国专利通过敲除GAL80，使该启动子不需要半乳糖诱导，并且仅受高葡萄糖抑制，低葡萄糖诱导，这就可以利用葡萄糖浓度对代谢途径进行控制。但是，利用葡萄糖进行代谢途径的表达调控在实际操作中并不方便，常常会出现泄漏表达，而且工业生产中工艺复杂，基因表达很难实现人为的控制。而申请号为CN201711403958.5的中国专利通过蛋白工程手段对Gal4进行改造，使它变成一种不借助于诱导剂，而是通过感知温度培养因子的变化来实现对代谢途径的调控。但这种方法需要精准的温度控制，并且需要低温，在实际生产中会增加能耗，产生额外的生产成本。所以，开发自调控体系，使其不受坏境条件调控，只对生长状态产生响应，对平衡细胞生长和产物积累具有重要的意义，对实际生产也有具有巨大的经济价值。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种重组酵母菌，所述的重组酵母菌表达番茄红素合成基因crtE、crtB和crtI，所述的crtE、crtB和crtI基因均置于生长偶联动态调控元件HSP26启动子之下，并以串联的形式整合于酿酒酵母基因组上，所述的crtE基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述的crtB基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述的crtI基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。所述的crtE、crtB和crtI基因来源于戈壁奇球菌(Deinococcusgobiensis)，经密码子优化后全基因合成，利用CRISPR/Cas9系统整合于酿酒酵母基因组。优选，所述的重组酵母菌过表达限速步骤动态调控HMGR基因，所述的HMGR基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述的HMGR基因置于生长偶联动态调控元件Cit1启动子之下，其效果优于置于HSP26启动子或HSP104启动子之下。优选，所述的重组酵母菌中酿酒酵母基因组的竞争性代谢途径ERG9启动子被生长偶联动态调控元件PDC1启动子替换。优选，所述的重组酵母菌中酿酒酵母基因组的的HMG1基因启动子及其调控区域被生长偶联动态调控元件Cit1启动子替换。优选，所述的重组酵母菌中酿酒酵母基因组的Ald6基因被敲除。本专利技术的第二个目的是提供上述的重组酵母菌在类胡萝卜素合成中的应用。与现有技术相比，本专利技术的优势在于：(1)本专利技术构建的番茄红素合成基因以串联的形式整合于基因组上，相较于分散表达拥有更高的表达活性。(2)本专利技术采用的生长偶联调控元件在关键基因(合成基因、限速步骤、竞争性途径)的调控中发挥着重要作用，既保证了必要的高表达，又防止代谢途径过早的进入目标代谢途径；在保证生长必需的同时使更多代谢流进入目标代谢途径。(3)本专利技术利用生长偶联调控元件在酿酒酵母中构建动态调控系统，该调控系统只对细胞生长状态产生响应，只有达到对数期后期，基因才进入表达高峰期，并持续稳定表达，不需要诱导剂，不需要进行参数调节(如葡萄糖浓度、温度等)，操作简便，易于控制，不会增加额外成本。附图说明图1为基因编辑系统pHCas9M-gRNA质粒图谱；图2为不同整合方式的生长偶联菌株(BD03、BX03、BL03)表达番茄红素的含量及构建的菌株示意图，其中A为BD03、BX03、BL03菌株表达番茄红素的含量，B为构建的BD03、BX03、BL03菌株示意图。图3为不同整合方式的生长偶联菌株(BD03、BX03、BL03)的crtE、crtB和crtI基因转录量，其中A为BD03、BX03、BL03菌株的crtB基因转录量；B为BD03、BX03、BL03菌株的crtI基因转录量；C为BD03、BX03、BL03菌株的crtE基因转录量。图4为BL03菌株在不同限速步骤调控模式(HSP26p-OhmgR、HSP104p-OhmgR、Cit1p-OhmgR)下表达番茄红素的含量和OhmgR基因转录量，其中A为BL03菌株在不同限速步骤调控模式下表达番茄红素的含量，B为BL03菌株在不同限速步骤调控模式下的OhmgR基因转录量。图5为BL03菌株在ALD6基因敲除、YPL062W基因敲除、ALD6基因和YPL062W基因同时敲除这三种情况下表达番茄红素的含量。图6为BL03菌株的ERG9启动子被PDC1启动子替换，或HMG1基因启动子及其调控区域被Cit1启动子替换后表达番茄红素的含量。图7为BL03菌株的ERG9启动子被PDC1启动子替换后的ERG9基因转录量。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细的说明，但本专利技术并不限于以下实施例。除非特别说明，下面实施例中所用的技术均为本领域内的技术人员已知的常规技术，所使用的仪器设备和试剂等，均为本领域内的技术人员可以通过公共途径如商购等获得的。实施例1基因编辑系统的构建为了方便酿酒酵母的基因操作，本专利技术首先基于pHCas9-Nours质粒(MolecularCloudCat.No.:MC_0000293)和pYES2-gRNA-hyg-MCS质粒(MolecularCloudCat.No.:MC_0000294)，构建了pHCas9M-gRNA质粒(Cat.No.:MC_0000739)。该质粒含有HCas9模块，gRNA表达模块，和G418模块，具体的，以引物HCas920170518-F/HCas920170518-R扩增得到HCas9片段，以引物G41820170518-F/G41820170518-R扩增得到G418片段，以引物2μ20170518-F/2μ20170518-R扩增得到2μ片段，以引物Amp20170518-F/Amp20170518-R扩增得到Amp片段，然后将以上片段使用重组试剂盒(ClonExpressMultiSOneStepCloningKit)，进行连接构建pHCas9M-gRNA质粒，所述的pHCas9M-gRNA质粒如图1所示。利用pHCas9M-gRNA质粒在进行基因操作时，不同位点只需将引导序列设计在引物中，方便快捷，转化后在400μg/mLG418YPD平板上进行筛选，获得阳性克隆后，经几次划线丢失质粒后，进行下一轮的操作，具体的，使用引物对pHCas9-gRNA-UP-F/pHCas9-gRNA-UP-R和pHCas9-gRNA-DOWN-F/pHCas本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组酵母菌，其特征在于，所述的重组酵母菌表达番茄红素合成基因crtE、crtB和crtI，所述的crtE、crtB和crtI基因均置于生长偶联动态调控元件HSP26启动子之下，并以串联的形式整合于酿酒酵母基因组上，所述的crtE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的crtB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的crtI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组酵母菌，其特征在于，所述的重组酵母菌表达番茄红素合成基因crtE、crtB和crtI，所述的crtE、crtB和crtI基因均置于生长偶联动态调控元件HSP26启动子之下，并以串联的形式整合于酿酒酵母基因组上，所述的crtE基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述的crtB基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述的crtI基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。2.根据权利要求1所述的重组酵母菌，其特征在于，所述的重组酵母菌过表达限速步骤动态调控HMGR基因，所述的HMGR基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。3.根据权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱红惠，苏卜利，宋丹丹，杨帆，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：广东,44