一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌、其制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种合成谷胱甘肽的基因工程菌，其制备方法及其应用,具体而言，本发明专利技术对整合有双功能酶的γ‑谷氨酰半胱氨酸合成酶‑谷胱甘肽合成酶(GshF)的基因工程菌株进行适应性实验室进化，提高了菌株谷胱甘肽产量；然后敲除进化菌株中参与合成L‑高半胱氨酸途径中胱硫醚β‑裂解酶基因，对参与半胱氨酸生物合成途径中的胱硫醚γ‑裂解酶和胱硫醚β‑合酶基因进行高表达调节，再组合表达一个具有多种生物活性的蛋白二硫键异构酶基因，从而获得了具有较高谷胱甘肽产量的基因工程菌株。本发明专利技术采用的策略为谷胱甘肽工程菌的遗传操作提供了一种技术借鉴。

【技术实现步骤摘要】
一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌、其制备方法及其应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及利用合成生物学技术构建一种具有高产谷胱甘肽的基因工程菌及其应用。
技术介绍
谷胱甘肽(glutathione,GSH)是细胞内含量最多的非蛋白质类巯基化合物，在由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经过酶催化反应合成。其因γ-羰基和游离的巯基而具有很多生物活性，如抗氧化，脱毒，免疫调节等。体内谷胱甘肽缺失与多种疾病有关，如夸休可尔症、癫痫、阿尔茨海默病等。因此，谷胱甘肽被广泛应用于药品、食品和化妆品等行业。目前，谷胱甘肽在国内主要用于药物领域，作为肝病和癌症治疗后的修复损伤的辅助用药，谷胱甘肽片(商品名：阿拓莫兰)和注射用还原型谷氨酸钠(商品名：古拉丁)，在国外则以食品添加剂及保健品为主。有人预测至2019年，全球谷胱甘肽需求量将达200-300吨。目前，谷胱甘肽生产的主要方法是酵母发酵法。由于野生型酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和产朊假丝酵母(Candidautilis)细胞中谷胱甘肽含量较高(0.1-1％)，且二者在廉价的营养贫乏的培养基中也能产生较高生物量，因此谷胱甘肽的生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌的制备方法，包括：i)把营养缺陷型宿主菌进行回复突变；ii)转化经密码子优化的能催化合成谷胱甘肽的双功能酶γ‑谷氨酰半胱氨酸合成酶‑谷胱甘肽合成酶基因进入宿主菌，并使其高表达；iii)对构建的工程菌株进行以丙烯醛为筛选压力的适应性实验室进化；iv)敲除宿主菌内源性的胱硫醚β‑裂解酶基因；v)提高宿主菌中内源性胱硫醚γ‑裂解酶基因的表达，进而提高代谢池内半胱氨酸水平，促进谷胱甘肽的生物合成；vi)提高宿主菌中内源性胱硫醚β‑合酶基因的表达，进而提高代谢池内半胱氨酸水平，促进谷胱甘肽的生物合成；vii)在宿主菌内转入蛋白二硫键异构酶基因；所述iv)、v)、vi)...

【技术特征摘要】
2017.12.15 CN 20171135117801.一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌的制备方法，包括：i)把营养缺陷型宿主菌进行回复突变；ii)转化经密码子优化的能催化合成谷胱甘肽的双功能酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶-谷胱甘肽合成酶基因进入宿主菌，并使其高表达；iii)对构建的工程菌株进行以丙烯醛为筛选压力的适应性实验室进化；iv)敲除宿主菌内源性的胱硫醚β-裂解酶基因；v)提高宿主菌中内源性胱硫醚γ-裂解酶基因的表达，进而提高代谢池内半胱氨酸水平，促进谷胱甘肽的生物合成；vi)提高宿主菌中内源性胱硫醚β-合酶基因的表达，进而提高代谢池内半胱氨酸水平，促进谷胱甘肽的生物合成；vii)在宿主菌内转入蛋白二硫键异构酶基因；所述iv)、v)、vi)、vii)以任意顺序操作完成后即得到高产谷胱甘肽的基因工程菌；所述的ii)可重复多次转化获得更高产的工程菌株；所述编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶-谷胱甘肽合成酶、胱硫醚γ-裂解酶、胱硫醚β-合酶和蛋白二硫键异构酶基因通过整合型方式高表达。2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，所述i)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)、vii)中的宿主菌选自酿酒酵母；所述编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶-谷胱甘肽合成酶、胱硫醚γ-裂解酶、胱硫醚β-合酶和蛋白二硫键异构酶基因由组成型启动子启动表达。3.如权利要求2的制备方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：王伟，周文龙，杨燕，刘忞之，
申请(专利权)人：中国医学科学院药物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11