一种磷酸化蛋白的富集方法和磷酸化蛋白的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种磷酸化蛋白的富集方法和磷酸化蛋白的检测方法，属于磷酸化蛋白富集检测技术领域。本发明专利技术所述磷酸化蛋白的富集方法包括以下步骤：将磷酸化蛋白样品、缓冲溶液与壳聚糖功能化磁性材料混合，磁分离后，得到富集有磷酸化蛋白的磁性材料；将所述富集有磷酸化蛋白的磁性材料与酸液混合，磁分离后，得到磷酸化蛋白的富集液；所述壳聚糖功能化磁性材料的内核为Fe3O4，Fe3O4外层依次包裹二氧化硅和壳聚糖聚合材料。本发明专利技术提供的富集方法能够克服传统免疫沉淀富集方法抗体的局限，具有广泛的适用性。

【技术实现步骤摘要】
一种磷酸化蛋白的富集方法和磷酸化蛋白的检测方法
本专利技术涉及蛋白质富集检测
，尤其涉及一种磷酸化蛋白的富集方法和磷酸化蛋白的检测方法。
技术介绍
蛋白质的翻译后修饰在生命过程中具有非常重要的作用，同一蛋白在不同位点的修饰可能对应不同的功能。蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的修饰方式之一，对许多生物的细胞功能起着生物“开/关”作用。因此，研究磷酸化蛋白质，建立高灵敏度检测技术，对于解析生命体复杂多样的生理和病理过程是非常有必要的。蛋白质发生磷酸化修饰后，其分子质量会发生相应的改变，通过质谱能够精确测定蛋白质的分子质量。但由于磷酸化蛋白的含量低且动态范围广,且带负电的磷酸化蛋白质在质谱分析较为常用的正离子模式下响应较弱，这些因素使低丰度磷酸化蛋白质相对于普通蛋白质鉴定有更大难度，因而在质谱检测前往往需要对发生修饰的磷酸化蛋白或肽段进行富集。目前最为常用的是免疫沉淀富集法，也就是利用抗体特异性识别磷酸化蛋白，进一步对富集得到的磷酸化蛋白进行质谱鉴定。但是由于抗体抗原反应的特异性，这种方法的富集效果和选择受到所选抗体的局限。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种磷酸化蛋白的富集方法和磷酸化蛋白的检测方法，本专利技术提供的富集方法能够克服传统免疫沉淀富集方法抗体的局限，具有广泛的适用性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种磷酸化蛋白的富集方法，包括以下步骤：将磷酸化蛋白样品、缓冲溶液与壳聚糖功能化磁性材料混合，磁分离后，得到富集有磷酸化蛋白的磁性材料；将所述富集有磷酸化蛋白的磁性材料与酸液混合，磁分离后，得到磷酸化蛋白的富集液；所述壳聚糖功能化磁性材料的内核为Fe3O4，所述Fe3O4外层依次包裹二氧化硅和壳聚糖聚合材料。优选的，所述壳聚糖功能化磁性材料由包括Fe3O4、水、正硅酸乙酯、交联剂和壳聚糖的原料制备得到。优选的，所述缓冲溶液的pH值为10～12。优选的，所述壳聚糖功能化磁性材料以悬浮液的形式提供，所述悬浮液中壳聚糖功能化磁性材料的浓度为1～10mg/mL。优选的，所述悬浮液中的液态物质为3wt.％的冰乙酸水溶液。优选的，所述悬浮液与缓冲溶液的体积比为1：(1～100)。优选的，所述酸液为质量浓度0.1％的三氟乙酸的水溶液。优选的，所述酸液与悬浮液的体积比为1:1。本专利技术还提供了一种磷酸化蛋白的检测方法，包括以下步骤：将上述技术方案任一项所述富集方法得到的磷酸化蛋白的富集液与芥子酸混合后，点在靶板上，采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪对磷酸化蛋白的含量进行测定。优选的，所述磷酸化蛋白的富集液与芥子酸的体积比为1:(1～3)。本专利技术提供了一种磷酸化蛋白的富集方法，包括以下步骤：将磷酸化蛋白样品、缓冲溶液与壳聚糖功能化磁性材料混合，磁分离后，得到富集有磷酸化蛋白的磁性材料；将所述富集有磷酸化蛋白的磁性材料与酸液混合，磁分离后，得到磷酸化蛋白的富集液；所述壳聚糖功能化磁性材料的内核为Fe3O4，Fe3O4外层依次包裹二氧化硅和壳聚糖聚合材料。本专利技术所述壳聚糖功能化磁性材料带正电，磷酸化蛋白带负电，混合后，磷酸化蛋白样品中的磷酸化蛋白与壳聚糖功能化磁性材料发生静电吸附，经磁分离后，得到富集有磷酸化蛋白的磁性材料；将所述富集有磷酸化蛋白的磁性材料与酸液混合，在酸性条件下，壳聚糖功能化磁性材料表面电荷发生变化，使磷酸化蛋白从壳聚糖功能化磁性材料表面解吸出来，经磁分离后，得到磷酸化蛋白的富集液，从而实现了磷酸化蛋白的富集。本专利技术提供的富集方法，无需采用抗体，因而不用受抗体的局限，具备广泛的适用性。此外，本专利技术的壳聚糖功能化磁性材料吸附洗脱条件温和，可大容量吸附磷酸化蛋白，从而降低成本，避免了蛋白的变性，增加了整个体系的生物相容性。本专利技术的壳聚糖功能化磁性材料在四氧化三铁外包覆一层二氧化硅，二氧化硅层能够保护四氧化三铁内核，使材料具有良好的磁性，便于分离；另外，二氧化硅层使壳聚糖功能化磁性材料还具有良好的亲水性，从而保障了壳聚糖功能化磁性材料在酸水溶液中具有良好的分散性。将本专利技术得到的磷酸化蛋白的富集液采用MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸飞行时间质谱)进行测定，具有较高的灵敏度。附图说明图1为壳聚糖功能化磁性材料的透射电镜照片；图2为实施例2测定的酪蛋白的MALDI质谱图；图3为对比例测定的酪蛋白的MALDI质谱图。具体实施方式本专利技术提供了一种磷酸化蛋白的富集方法，包括以下步骤：将磷酸化蛋白样品、缓冲溶液与壳聚糖功能化磁性材料混合，磁分离后，得到富集有磷酸化蛋白的磁性材料；将所述富集有磷酸化蛋白的磁性材料与酸液混合，磁分离后，得到磷酸化蛋白的富集液；所述壳聚糖功能化磁性材料的内核为Fe3O4，Fe3O4外层依次包裹二氧化硅和壳聚糖聚合材料。本专利技术将磷酸化蛋白样品、缓冲溶液与壳聚糖功能化磁性材料混合，磁分离后，得到富集有磷酸化蛋白的磁性材料。在本专利技术中，所述缓冲溶液的pH值优选为10～12，所述缓冲溶液优选为氯化铵/氨水缓冲溶液、碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液。本专利技术对所述磷酸化蛋白样品中磷酸化蛋白的含量没有特殊要求，任意含量均可。本专利技术对所述磷酸化蛋白样品中磷酸化蛋白的具体种类没有特殊要求，任意需要富集的磷酸化蛋白均可。在本专利技术的具体实施方式中，所述磷酸化蛋白优选为酪蛋白。在本专利技术中，所述壳聚糖功能化磁性材料的内核为Fe3O4，所述Fe3O4外层依次包裹二氧化硅和壳聚糖聚合材料。本专利技术所述的壳聚糖功能化磁性材料在四氧化三铁外包覆一层二氧化硅，二氧化硅层能够保护四氧化三铁内核，使材料具有良好的磁性，便于分离；另外，二氧化硅层使壳聚糖功能化磁性材料还具有良好的亲水性，从而保障了壳聚糖功能化磁性材料在酸水溶液中具有良好的分散性。在本专利技术中，所述壳聚糖功能化磁性材料优选由包括Fe3O4、水、正硅酸乙酯、交联剂和壳聚糖的原料制备得到，所述壳聚糖功能化磁性材料的制备优选包括以下步骤：在碱性条件下，将正硅酸乙酯、水与Fe3O4进行反应，得到Fe3O4@SiO2磁性颗粒；将所述Fe3O4@SiO2磁性颗粒与壳聚糖、交联剂进行交联反应，得到壳聚糖功能化磁性材料。本专利技术优选在碱性条件下，将正硅酸乙酯、水与Fe3O4进行反应，得到Fe3O4@SiO2磁性颗粒。本专利技术对所述正硅酸乙酯的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的市售商品即可。本专利技术对所述Fe3O4的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的市售商品或自行制备得到均可。当所述Fe3O4自行制备得到时，所述Fe3O4的制备优选包括以下步骤：将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O混合，加入酸调整混合液的pH值至酸性，超声一段时间，加入碱调整超声后混合液的pH值＞10进行共沉淀反应，经磁分离后得到Fe3O4。本专利技术将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O混合，加入酸调整混合液的pH值至酸性，得到酸性混合液。在本专利技术中，所述FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O的摩尔比优选为4:3。本专利技术对所述FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O的混合方式没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的混合方式即可。在本专利技术中，所述酸优选为浓盐酸，所述浓盐酸的质量浓度优选为36～38％。得到酸性混合液后，本专利技术对所述酸性混合液进行超声本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种磷酸化蛋白的富集方法，包括以下步骤：将磷酸化蛋白样品、缓冲溶液与壳聚糖功能化磁性材料混合，磁分离后，得到富集有磷酸化蛋白的磁性材料；将所述富集有磷酸化蛋白的磁性材料与酸液混合，磁分离后，得到磷酸化蛋白的富集液；所述壳聚糖功能化磁性材料的内核为Fe3O4，所述Fe3O4外层依次包裹二氧化硅和壳聚糖聚合材料。

【技术特征摘要】
1.一种磷酸化蛋白的富集方法，包括以下步骤：将磷酸化蛋白样品、缓冲溶液与壳聚糖功能化磁性材料混合，磁分离后，得到富集有磷酸化蛋白的磁性材料；将所述富集有磷酸化蛋白的磁性材料与酸液混合，磁分离后，得到磷酸化蛋白的富集液；所述壳聚糖功能化磁性材料的内核为Fe3O4，所述Fe3O4外层依次包裹二氧化硅和壳聚糖聚合材料。2.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，所述壳聚糖功能化磁性材料由包括Fe3O4、水、正硅酸乙酯、交联剂和壳聚糖的原料制备得到。3.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，所述缓冲溶液的pH值为10～12。4.根据权利要求1～3任一项所述的富集方法，其特征在于，所述壳聚糖功能化磁性材料以悬浮液的形式提供，所述悬浮液中壳聚糖功能化磁性材料的浓度为1～1...

【专利技术属性】
技术研发人员：周焕英，高志贤，梁俊，王蕊，王永辉，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12