一种RNA荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种检测RNA的荧光探针，其化学结构式为：

【技术实现步骤摘要】
一种RNA荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种检测RNA存在与分布的荧光探针，属于有机小分子荧光探针领域。
技术介绍
在细胞内的各种生命物质中，核糖核酸(RNA)是重要的生物大分子，在蛋白质合成过程中起着重要作用，其中转移RNA（tRNA）携带和转移活化氨基酸；信使RNA（mRNA）是合成蛋白质的模板；核糖体RNA（rRNA），是细胞合成蛋白质的主要场所。另外其在催化生物反应、基因表达调控等生物学过程中扮演着极其重要的角色。RNA主要存在于细胞核的核仁区和细胞质中，其定位、活动、多寡、形态等包含着重要的生命科学信息，这些信息与医学诊断和治疗息息相关。因此，核仁和细胞质中的RNA成像对生物化学、生物医药、生命科学等具有十分重要的意义。目前的荧光成像技术，在实时监测活细胞中生物分子的形态、多寡等方面得到了广泛应用。荧光成像技术具有高检测灵敏度、生物样品低损伤以及可以动态分析活的样品等优势，克服了其他检测方法价格昂贵，设备要求高，技术操作相对复杂等缺点，获得了生物、生命、医学等学科研究者们的青睐。为适应当前形势，各种能够成像活细胞内不同靶标的荧光探针已成为研究热点。与众多的商业化探针(如DNA探针)相比，RNA探针非常少，因为现有核酸探针一般与双链DNA有较大的亲和性，且小分子与RNA的作用机理尚不清楚，所以RNA探针的研究是比较困难的。目前只有分子探针公司(MolecularProbesCo.)提供了一个可用于RNA成像的探针“SYTORNA-Select”，但该探针的化学结构式仍未对外公布。目前RNA可视探针的缺乏已经限制了病理学研究和药物的开发。所以，发展新型结构和功能的RNA荧光探针迫在眉睫。
技术实现思路
针对目前缺乏RNA探针的问题，本专利技术提供一种检测RNA的荧光探针，具有膜通透性好、细胞毒性小等优点。本专利技术的另一目的是提供一种上述荧光探针的合成方法，原料易得，合成步骤简单，收率高。本专利技术的再一目的是提供一种上述荧光探针在检测细胞中RNA分布的应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种检测RNA的荧光探针，其化学名称为1-甲基-4-（（E）-3-（（E）-1,3,3-三甲基二氢吲哚-2-亚基）丙-1-烯-1-基）吡啶-1-碘盐，简称BHI，其化学结构式如式（I）所示：式（I）。上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：（1）4-甲基吡啶与碘甲烷在乙醇中加热反应，反应后分离得到1,4-二甲基-吡啶碘盐（化合物1）；（2）1,4-二甲基-吡啶碘盐和1，3，3-三甲基-2-亚甲基吲哚啉乙醛溶于乙醇中，在吡咯烷存在下室温搅拌，有固体析出，过滤得粗产物，提纯后得产物，即RNA荧光探针。步骤（1）中，4-甲基吡啶中与碘甲烷的摩尔比为1:1.2。步骤（2）中，1,4-二甲基-吡啶碘盐与1，3，3-三甲基-2-亚甲基吲哚啉乙醛的摩尔比为1：1；1,4-二甲基-吡啶碘盐与吡咯烷的摩尔比为1:1-9。步骤（1）中，反应温度为90℃，反应时间为24-48小时。步骤（2）中，提纯方法为乙醇中重结晶。上述荧光探针的合成路线如下：。一种上述荧光探针在检测、标记或显示细胞中RNA的存在与分布中的应用。可采用波长为488nm的单光子激发，检测波段为红光波段550-650nm。本专利技术的荧光探针工作原理如下：本专利技术的探针以吲哚为母体，通过双键桥连吡啶盐构建了荧光探针。合适大小的共轭结构以及强的吸电子基团保证了红光发射；该探针特定的结构赋予其可以与RNA沟槽区域相嵌合从而识别RNA。本专利技术具有以下优点：本专利技术提供的荧光探针是一类新型的RNA荧光探针分子，与其功能相近的荧光探针比，本专利技术所述探针具有低生物毒性、膜通透性好的特点，作为RNA荧光探针具有广泛的应用，有望开发为RNA的生理和病理学研究用简洁、直观的生物检测试剂。附图说明图1为化合物1的1HNMR谱；图2为荧光探针BHI的1HNMR谱；图3为荧光探针BHI的13CNMR谱；图4为探针BHI对RNA的滴定荧光光谱图片；图5为探针BHI对固定细胞成像图片；图6为探针BHI对RNase处理后固定细胞成像图片；图7为探针BHI的细胞毒性测试结果。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1荧光探针的合成（1）1,4-二甲基-吡啶碘盐的合成：向圆底烧瓶中加入8mL乙醇，然后加入1mL的4-甲基吡啶，加入0.755mL的碘甲烷溶液，加热至90℃反应24h，反应完毕后将反应体系冷却至室温，有固体析出，过滤并使用乙醇洗涤可得到1,4-二甲基-吡啶碘盐（化合物1），产率为92%。其核磁共振氢谱如图1所示：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.84(s,2H),7.97(s,2H),4.27(s,3H),2.61(s,3H)；（2）RNA探针BHI的合成：取化合物1（0.6g，2mmol）加入圆底烧瓶中，加入5mL的乙醇，加入1eq的1，3，3-三甲基-2-亚甲基吲哚啉乙醛，加入1eq的吡咯烷，室温搅拌12h，有大量固体析出，过滤可得粗产物，粗产物用无水乙醇重洗三遍，然后在乙醇中重结晶，得纯品BHI，产率为48%。其核磁氢谱与碳谱如图2和图3所示：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.40(d,J=6.9Hz,2H),8.05–7.95(m,1H),7.85(d,J=6.8Hz,2H),7.42(d,J=7.2Hz,1H),7.25(d,J=7.5Hz,1H),7.06(s,1H),7.01(s,1H),6.33(s,1H),5.79(s,1H),4.07(s,3H),3.34(s,3H),1.62(s,6H).13CNMR(101MHz,DMSO)δ165.52,153.56,144.37,143.19,139.77,128.56,127.70,122.04,120.17,116.67,108.63,97.68,47.09,47.09,47.05,46.24,46.23,46.05,40.64,40.43,40.22,40.02,39.81,39.60,39.39,29.95,28.65。实施例2荧光探针对RNA的响应配置实施案例1中制备的荧光探针的DMSO母液，浓度为1mM。然后分别取5μL探针母液加入5mL容量瓶中，每个容量瓶中加入同浓度不同体积的RNA溶液，最后用PBS缓冲溶液定容到5mL，使RNA的浓度与探针浓度的当量比分别为5，20，40，60，100，200，300，400，500，600。然后进行荧光检测（激发波长500nm）。以波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图4。由图可以看出，探针本身的荧光很弱，当RNA与探针当量比为600时，荧光强度增强了4倍。实施例3荧光探针BHI对细胞的荧光成像配制实施例1中制备的荧光探针DMSO母液，浓度为1mM。再取20μL用lmL培养基稀释，得终浓度为20μM的探针稀释液。将接种好的细胞用lmL多聚甲醛处理30min后用PBS洗3次，然后用0.5mL5%的TritonTMX-100处理3min，最后在探针稀释液中室温孵育30min，用PBS洗3次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行明场成像与荧光成像(激发波长488nm，发射波段550-650nm本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测RNA的荧光探针，其化学名称为1‑甲基‑4 ‑（（E）‑3 ‑（（E）‑1,3,3‑三甲基二氢吲哚‑2‑亚基）丙‑1‑烯‑1‑基）吡啶‑1‑碘盐，其化学结构式如式（I）所示：

【技术特征摘要】
1.一种检测RNA的荧光探针，其化学名称为1-甲基-4-（（E）-3-（（E）-1,3,3-三甲基二氢吲哚-2-亚基）丙-1-烯-1-基）吡啶-1-碘盐，其化学结构式如式（I）所示：式（I）。2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）4-甲基吡啶与碘甲烷在乙醇中加热反应，反应后分离得到1,4-二甲基-吡啶碘盐；（2）1,4-二甲基-吡啶碘盐和1，3，3-三甲基-2-亚甲基吲哚啉乙醛溶于乙醇中，在吡咯烷存在下室温搅拌，有固体析出，过滤得粗产物...

【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，孙洁，田明刚，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37