一种基于EST-SSR标记的甜瓜杂交种津甜100种子纯度鉴定的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于EST‑SSR标记的甜瓜品种“津甜100”杂交种种子纯度鉴定的方法。该方法以甜瓜品种“津甜100”杂交种及其双亲的基因组DNA为模板，通过Gene Bank数据库上公布甜瓜EST序列，利用Primer 3.0在线引物设计，设计EST‑SSR引物。经过筛选，得到1对杂交种带型为双亲的互补带型引物，经田间验证试验引物稳定性良好，且与田间试验结果较为吻合，能够对甜瓜杂交品种进行纯度鉴定。本发明专利技术的检测方法在3h之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、低成本、操作方便等优势。

A Method for Seed Purity Identification of Muskmelon Hybrid Jintian 100 Based on EST-SSR Marker

The invention discloses a method for seed purity identification of melon variety \Jintian 100\ hybrid seed based on EST SSR marker. The method used the genomic DNA of \Jintian 100\ hybrid and its parents as template, published EST sequence of melon through Gene Bank database, and designed EST SSR primers using Primer 3.0 online primer design. After screening, a pair of complementary band primers with parental band type were obtained. The stability of the primers was good through field validation test, which was in good agreement with the field test results and could be used for purity identification of Melon Hybrid varieties. The detection method of the invention can complete the seed purity identification within 3 hours, and has the advantages of fast, low cost, convenient operation, etc.

【技术实现步骤摘要】
一种基于EST-SSR标记的甜瓜杂交种津甜100种子纯度鉴定的方法
本专利技术属于农业的蔬菜育种与应用
，具体涉及甜瓜杂交种“津甜100”纯度鉴定方法，是一种基于EST-SSR分子标记技术的杂交种种子纯度鉴定方法。
技术介绍
“津甜100”是天津科润蔬菜研究所全新培育的薄皮甜瓜新品种，植株长势旺盛，综合抗性好，以孙蔓结果为主。果实发育期30天，果实矮梨形，单果重500～600克。果皮白色，成熟后微有黄晕，果面光洁。果肉白色，平均可溶性固形物含量16.0％，肉质脆，香味浓郁，口感风味俱佳。甜瓜种子纯度的高低是直接衡量种子质量优劣的主要指标。种子纯度降低会显著降低作物的产量和产品品质，使农民蒙受巨大的经济损失。传统的种子纯度鉴定方法是以播种后植株的田间形态观察为依据，其周期长、工作量大，且易受环境、季节因素影响，导致结果存在偏差。因此，开发快速、准确的种子纯度鉴定方法已成为种子科研单位和企业共同关注的课题。EST-SSR标记因其具有共显性、多态性高、实验程序简单等优点，是目前作物品种鉴定和种子纯度鉴定研究中最常用的标记之一。近年来，随着测序技术的不断提高和分子生物学的深入研究，大量瓜类作物的EST被测序，迄今为止，国际葫芦科基因组计划研究小组共收录西瓜ESTs588789条，甜瓜129067条，黄瓜513276条。
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开了一种基于EST-SSR分子标记技术的甜瓜杂交种“津甜100”种子纯度鉴定方法，为实现上述目的，本专利技术提供如下的技术方案：本方法通过对供试甜瓜杂交种“津甜100”进行DNA提取、PCR扩增和EST-SSR分析，确认了杂交种及其双亲稳定的共显性互补带型，从而对甜瓜杂交种“津甜100”种子进行纯度鉴定。用于鉴定甜瓜杂交种“津甜100”种子纯度的SSR引物，包括上游引物序列：5’-ATATTCACCAAACCCCTAAG-3’，下游引物序列：5’-GGATAGCAATTAACCCACC-3’。本专利技术所述快速鉴定甜瓜杂交种种子纯度的方法，该方法以温室甜瓜品种“津甜100”供试种子的基因组DNA为模板，对已知品种“津甜100”亲本DNA差异性片段进行分析。供试甜瓜杂交种取样及DNA提取方法为：对温室甜瓜随机取样，总共50株，取靠近根部的嫩叶部分50～100mg，液氮冷冻研磨(RetschMM400生物粉碎仪)，加入CTAB裂解缓冲液(20g/LCTAB，1.4MNaCl，0.1MTris-HCl，20mMEDTANa2)500μL，65℃恒温水浴(Neslab)裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒(赛百盛)操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1ng/μL，NanodropND1000，Thermo)。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。供试甜瓜杂交种PCR方法为：(1)SSR上游引物序列：5’-ATATTCACCAAACCCCTAAG-3’，SSR下游引物序列：5’-GGATAGCAATTAACCCACC-3’。(2)采用上述SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：MasterMix5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.5μL，供试甜瓜杂交种基因组DNA模板(50ng/μL)1μL，双蒸水补足10μL；PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环(94℃45sec，55℃45sec，72℃45sec)；72℃延伸7min，4℃保存；(3)供试甜瓜杂交种PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8％，凝胶组分为：去离子水21mL，10×TBE3mL，40％PAG6mL，TMED30μL，10％过流酰胺300μL；设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；(4)供试甜瓜杂交种EST-SSR结果分析，比较杂交种及其双亲的特征谱带，对供试种子样品进行共显性互补带型分析，通过计算供试品种样品中杂交种数量占总样品数量的比例确定种子纯度。本专利技术的检测方法在不计算DNA提取过程耗时的情况下，PCR耗时90min，EST-SSR分析60-90min，所以本专利技术的检测方法在3h之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、低成本、操作方便等优势。为了能更加清楚的说明本专利技术的测定方法，下面对本专利技术的试验方法做以详细的说明。1、原理本方法应用一种新型的核酸分析方法其原理是：EST-SSR是以1～6个碱基为重复单元，是存在于EST中的SSR。EST(Expressedsequencetag，表达序列标签)是将mRNA在体外反转录成cDNA并克隆到质粒或噬菌体载体构建cDNA文库后，大规模随机挑取cDNA克隆，对其5’端或3’端进行测序后获得的长约150～500bp的表达序列片段。EST序列来自实验室构建的cDNA文库或从美国国家生物信息中心(NCBI)的Genbank中下载。采用相关软件合成引物，最后对研究材料进行PCR扩增和凝胶电泳，通过特异谱带进行分析，从而计算杂交种的纯度。2、引物设计通过GeneBank数据库上公布的214条甜瓜EST序列，利用Primer3.0在线引物设计，引物由上海生工合成，经筛选获得了1对EST-SSR引物可用于甜瓜杂交种种子纯度鉴定。引物由上海生物工程公司合成。表1引物序列表如下：3、取样及DNA提取对温室甜瓜进行随机取样，总共50株，取靠近根部的嫩叶部分50～100mg，液氮冷冻研磨(RetschMM400生物粉碎仪)，加入CTAB裂解缓冲液(20g/LCTAB，1.4MNaCl，0.1MTris-HCl，20mMEDTANa2)500μL，65℃恒温水浴(Neslab)裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒(赛百盛)操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1ng/μL，NanodropND1000，Thermo)。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。4、PCR反应采用SSR上游引物序列：5’-ATATTCACCAAACCCCTAAG-3’，SSR下游引物序列：5’-GGATAGCAATTAACCCACC-3’。SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增(仪器为ABIVeritiPCR)，其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：MasterMix5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.5μL，供试甜瓜杂交种基因组DNA模板(50ng/μL)1μL，双蒸水补足10μL。PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环(94℃45sec，55℃45sec，72℃45sec)；72℃延伸7min，4℃保存。5、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染供试甜瓜杂交种PCR扩增产物进行凝胶电泳(仪器为BIO-RAD电泳仪)，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8％，凝胶组分为：去离子水21mL，10×TBE3mL，40％PAG6mL，TMED30μL，10％过流酰胺300μL；上样1～2μL，设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；染色过程(仪器为ORBITAL脱色摇床)：于600mL超纯水中加入6m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于鉴定甜瓜杂交种“津甜100”种子纯度的1对SSR引物，其特征在于，包括上游引物序列：5’‑ ATATTCACCAAACCCCTAAG ‑3’， 下游引物序列： 5’‑ GGATAGCAATTAACCCACC ‑3’。

【技术特征摘要】
1.用于鉴定甜瓜杂交种“津甜100”种子纯度的1对SSR引物，其特征在于，包括上游引物序列：5’-ATATTCACCAAACCCCTAAG-3’，下游引物序列：5’-GGATAGCAATTAACCCACC-3’。2.一种采用权利要求1所述引物，基于EST-SSR标记的甜瓜杂交种“津甜100”种子纯度鉴定的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）采用权利要求1所述的SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×GoTaq®MasterMix5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.5μL，供试甜瓜杂交种基因组DNA模板（50ng/μL）1μL，双蒸水补足10μL；...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰青阔，王成，赵新，张若纬，武云鹏，张耀中，彭冬秀，焦贺敏，李秀秀，王永，
申请(专利权)人：天津市农业质量标准与检测技术研究所，天津科润农业科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12