一种从微生物发酵得到的毛油中富集多不饱和脂肪酸的方法技术

本发明专利技术涉及脂肪酸的生物分离及酶催化技术领域，具体涉及一种从微生物发酵得到未精炼的毛油中富集多不饱和脂肪酸的方法，包括以下步骤：（1）将发酵制得的毛油通过酶法水解得到游离的脂肪酸；（2）利用醇与不饱和脂肪酸脂肪酸和饱和脂肪酸反应速率的差异，除去部分饱和脂肪酸，而将剩余未反应目标脂肪酸提取；（3）将步骤（2）得到的脂肪酸再利用多级分子蒸馏富集得到高纯度的多不饱和脂肪酸。以上步骤均以海泡石为过滤剂，基于以上分离纯化，富集耦合多不饱和脂肪酸形成的本发明专利技术方法，以微生物发酵得到毛油为原料，可制得PUFAs≥95%。本发明专利技术是一种通过绿色高效的水解和富集方法得到高纯度的多不饱和脂肪酸方法，创造性的以毛油为初始原料，省去了藻油精炼工段，过程环境友好，清洁，并且极大的提高了产率。

A Method for Enriching Polyunsaturated Fatty Acids in Crude Oil Fermented by Microorganisms

The invention relates to the field of fatty acid biological separation and enzyme catalysis technology, in particular to a method for enriching polyunsaturated fatty acids from uncultivated crude oil by microbial fermentation, including the following steps: (1) hydrolyzing the fermented crude oil to obtain free fatty acids by enzymatic hydrolysis; (2) using the difference of reaction rate between alcohol and unsaturated fatty acids and saturated fatty acids. In contrast, the remaining unreacted target fatty acids are extracted by removing partial saturated fatty acids; (3) the fatty acids obtained by step (2) are enriched by multi-stage molecular distillation to obtain high purity polyunsaturated fatty acids. In the above steps, sepiolite is used as a filter agent, based on the above separation and purification, enrichment and coupling of polyunsaturated fatty acids to form the method of the invention, using microbial fermentation to obtain crude oil as raw material, PUFAs can be prepared up to 95%. The present invention is a green and efficient hydrolysis and enrichment method to obtain high purity polyunsaturated fatty acid. It uses crude oil as the initial raw material creatively, eliminates the algae oil refining section, and the process is environmentally friendly, clean, and greatly improves the yield.

【技术实现步骤摘要】
一种从微生物发酵得到的毛油中富集多不饱和脂肪酸的方法
本专利技术涉及一种从微生物发酵得到的毛油中，分离纯化多不饱和脂肪酸，经由酶法水解，酶法除杂酸以及多级分子蒸馏富集多不饱和脂肪酸的方法。
技术介绍
多不饱和脂肪酸（PUFAs）对人体健康有着重大的作用，其中的二十二碳六烯酸（cis-4,7,10,13,16,19-DocosahexaenoicAcid，DHA）和二十碳二五烯酸（Docosapentaenoicacid，DPA）尤为突出。一方面，DHA俗称“脑黄金”，能够直接进入大脑，是神经系统中脂肪酸的重要组成成分，对小儿力和神经的发育有显著功能，可完善大脑功能、促进大脑发育、提高视力、预防心血管类疾病、抗癌等。另一方面，DPA具有抗癌的功效，对胃癌等多种癌症都具有预防功能，还具有抗炎功效，通过影响细胞因子或者酶的表达，降低致炎因子活性，从而在一定程度上治疗风湿性关节炎、牛皮鲜、系统性红斑狼疮等疾病。从原油中分离纯化得到高纯度的多不饱和脂肪酸，其原料来源尤为关键。PUFAs传统食物来源于深海鱼类，深海鱼类中存在许多有毒有害物质，如二恶英（Dioxin）、毒杀芬等，人类在海洋中排放的重金属元素也会在海鱼的体内积累，大大影响了DHA的品质。DPA存在于一些海洋哺乳动物的油脂中，例如海豹油中DPA的含量在5%-6%，由于处理过程复杂，产品腥味难以去除，以及食物链的富集作用导致深海鱼油中重金属离子和有机污染物含量较高，存在安全隐患。但是，以真菌和藻类合成的产品几乎不含EPA、无污染、环境友好、纯净、稳定性好、腥味小，不含胆固醇，在各种藻类中,甲藻纲具有高含量的PUFAs，近年来以发酵得到的藻油替代深海鱼油作为DHA和DPA的来源已成为一种发展趋势。由发酵得到的藻油富集PUFAs，传统工艺中都是以精炼的藻油为初始原料，精油是由毛油通过脱胶、脱酸、脱色、脱溴等工段获得。例如中国专利CN104394702B，用于不断富集由微藻产生的、具有DHA乙酯的一种油的方法。藻油精炼过程，必须使用大量的强酸强碱以及有机溶剂，并且工段复杂耗时，这样使得成本过高。因此，本专利技术创造性的以毛油为原料，利用脂肪酶水解酶的选择专一性直接水解，过程简单，水解率极高，一方面，水解获得游离的脂肪酸，另一方面，达到了脱胶、脱酸、脱色效果，同时，通过多级分子蒸馏富集达到脱溴效果。直接以毛油为初始原料，省去了藻油的精炼工段，过程简单，环境友好，成本低。藻油的水解，富集工段中，都需要通过过滤去除部分固体以及杂质，传统工段中都是使用活性白土、活性炭以及硅藻土过滤。本专利技术创造性的以海泡石为过滤剂除杂，海泡石，是大自然中一种镁质硅酸盐类粘土化合物，化学式是Mg8Si12O30(OH)4(OH2)4·8H2O（SEP4H2O，8H2O），由于海泡石是具有较大比表面积以及层状多孔的由SiO2四面体与Mg-O八面体嫁接而成的三维立体特殊结构，在其表面还存在较多的酸性[SiO4]碱性[MgO6]中心，从而使海泡石具有较强的吸附性能，以此来吸附除杂，效果良好，完全可以替代传统的活性白土、活性炭和硅藻土。所选用的海泡石来源于湖南省湘潭市境内海泡石矿产。从微生物发酵得到的藻毛油中富集PUFAs，经由水解，分离、富集等步骤。一方面，藻油水解传统工艺主要是通过化学法水解，局限性在于，工段中使用大量的强酸强碱以及有机溶剂，反应温度高，且水洗处理过程中产生大量的废水，污染环境。另一方面，水解得到的游离脂肪酸必须通过富集得到多不饱和脂肪酸，传统的富集方法主要包括：尿素包合法、金属盐沉淀法、低温冷冻法、超临界气体萃取法等。蔡双飞等人用尿素包合法处理多不饱和脂肪酸甲酯，甲酯PUFA的含量由47.7%提高到86.7%，但是，尿素包合工段中使用大量的有机溶剂，且尿素必须滤除，收率低；郑公铭等将盐析法和尿素包合法相结合，对海洋动物中的DPA等PUFAs进行纯化，最终DPA等PUFAs的比例达到了酸的70%-75%，但是，过程中的盐类物质无法重复利用，对环境造成较大污染；王晓玲等人利用结晶法，在低温条件下对一种昆虫中的PUFAs进行富集，在-8℃时，原料中两种PUFAs的含量分别提高了17.08%和6.59%，但是，过程中使用大量有机溶剂，有残留，产率较低；超临界气体萃取法，V.Riha等人利用该方法对非游离型的DHA产品进行纯化，PUFA总含量可达96%，缺点在于设备成本高于一般方法。综上，传统的水解和富集方法，要么是使用大量的有机溶剂，污染环境，要么是设备成本高，产率低。因此，寻求一种绿色高效的水解和富集方法，分离纯化得到高纯度的多不饱和脂肪酸具有十分重要的研究价值和应用前景。
技术实现思路
本专利技术属于脂肪酸的生物分离及酶催化
，本专利技术的目的是提供一种从微生物发酵制得的毛油中，通过绿色高效的水解和富集方法得到高纯度的多不饱和脂肪酸方法，过程环境友好，清洁，并且极大的提高了产率。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：从微生物发酵制得的毛油中，分离纯化得到高纯度的多不饱和脂肪酸方法，将发酵制得的毛油通过酶法水解得到游离的脂肪酸，水解酶可重复使用；利用醇与目标脂肪酸和杂酸反应速率的差异，用脂肪酶催化进行酯化除杂，将饱和脂肪酸酯化富集于酯中，而将剩余未反应目标脂肪酸提取，其中所述醇为正己醇、正癸醇、十二醇、十四醇等，水解和酶法富集使用的脂肪酶可选自Novozym435脂肪酶、Rhizomucormiehei脂肪酶、Alcaligenessp.脂肪酶以及Candidasp.99-125脂肪酶，优选Candidasp.99-125脂肪酶，该脂肪酶是依照中国专利技术专利CN1948470A的方法制备；将酶法富集得到的脂肪酸利用多级分子蒸馏富集得到高纯度的多不饱和脂肪酸。水解，富集工段中得到的反应液以海泡石为过滤剂过滤得到粗品，所选海泡石含量25%、40%、55%、75%、90%，优先75%含量。其具体操作步骤如下：（1）水解反应：油水比为1:0.2-0.6，酶量：50-300单位/油脂，反应温度20℃-50℃，反应时间56h-90h，搅拌速度300rpm/min-500rpm/min。水解过程中根据水解率，适当补加脂肪酸中和剂，反应结束后分离出水解酶，水化层经酸化，静置，萃取，水洗，除水，海泡石过滤及蒸发，获得游离脂肪酸。（2）酶法富集：游离脂肪酸和醇的质量比为1:0.166-0.3，酶量为酸质量的6%-15%，反应时间2h-6h，反应温度30℃-50℃，适当的正己烷溶剂，搅拌速度200rpm/min-300rpm/min。转化率达到75-85%，到达酯化除杂的效果，反应结束后将反应液用海泡石过滤，离心分离，脂肪酶可重复利用，而将剩余未反应目标脂肪酸提取，用于下步分子蒸馏富集。（3）分子蒸馏富集：将步骤（2）中的游离脂肪酸在分子蒸馏装置中蒸馏，一级蒸馏，蒸发器温度：50℃-85℃，冷凝面温度：30℃-50℃，真空度：2.5-4.5*10-1mbar；保留一级分子蒸馏后的重组分进行二级分子蒸馏，蒸发器温度：85℃-115℃，冷凝面温度：45℃-75℃，真空度：2.5-3.5*10-2mbar；保留二级分子蒸馏后的重组分进行三级分子蒸馏，蒸发器温度：115℃-140℃，冷凝面温度：55℃-90℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从微生物发酵制得的毛油中，分离纯化得到高纯度的多不饱和脂肪酸方法，将发酵制得的毛油通过酶法水解得到游离的脂肪酸，毛油和水按一定比例混合在水解酶催化下，高效绿色反应，反应条件温和，藻油水解率极高，反应结束后将反应液用海泡石过滤，离心分离，酶可重复使用；利用醇与目标脂肪酸和杂酸反应速率的差异，用脂肪酶催化进行酯化除杂，将饱和脂肪酸酯化富集于酯中，而将剩余未反应目标脂肪酸提取；将酶法富集得到的脂肪酸再利用多级分子蒸馏富集得到高纯度的多不饱和脂肪酸。

【技术特征摘要】
1.一种从微生物发酵制得的毛油中，分离纯化得到高纯度的多不饱和脂肪酸方法，将发酵制得的毛油通过酶法水解得到游离的脂肪酸，毛油和水按一定比例混合在水解酶催化下，高效绿色反应，反应条件温和，藻油水解率极高，反应结束后将反应液用海泡石过滤，离心分离，酶可重复使用；利用醇与目标脂肪酸和杂酸反应速率的差异，用脂肪酶催化进行酯化除杂，将饱和脂肪酸酯化富集于酯中，而将剩余未反应目标脂肪酸提取；将酶法富集得到的脂肪酸再利用多级分子蒸馏富集得到高纯度的多不饱和脂肪酸。2.根据权利要求1所述从微生物发酵制得的毛油中，分离纯化得到高纯的多不饱和脂肪酸方法，其特征在于：通过酶法水解，酶法富集与多级分子蒸馏富集得到高纯度的多不饱和脂肪酸。3.据权利要求1所述从微生物发酵制得的藻油中，分离纯化得到高纯度的多不饱和脂肪酸方法，水解酶为脂肪酶酶粉或者酶液，水解和酶法富集使用的脂肪酶可选自Novozym435脂肪酶、Rhizomucormiehei脂肪酶、Alcaligenessp.脂肪酶以及Candidasp.99-125脂肪酶，优选Candidasp.99-125脂肪酶，该脂肪酶是依照中国发明专利CN1948470A的方法制备，水解酶量为50-300单位/油脂，酶催化除杂的酶量为酸质量的6%-15%。4.据权利要求1所述从微生物发酵制得的毛油中，分离纯化得到高纯度多不饱和脂肪酸方法，水解步骤中，油水比为1:0.2-0.6任意比列，酶量：50-300单位/油脂，反应温度30℃-50℃，反应时间56h-90h，搅拌速度300rpm/min-500rpm/min，水解过程中根据水解率，适当补加脂肪酸中和剂，所述脂肪酸中和剂为NaOH或KOH。5.据权利要求4所述方法，与传统化学法水解相比，酶法水解避免使用有机溶剂，高效绿色，反应条件...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭新，
申请(专利权)人：湖南万全裕湘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43