天赐霉素的高产菌株及其发酵工艺和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种天赐霉素的高产菌株及其发酵工艺和应用。该高产菌株为一株链霉菌，该链霉菌为Streptomyces sp.CB03234‑R‑16，已于2017年9月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2017556。本发明专利技术通过对产生活性天赐霉素(天赐米星)的原始菌种CB03234进行基于化学诱变和核糖体工程的菌种进化，最终筛选获得一株高产菌株CB03234‑R‑16，其天赐霉素(TNM A)的发酵产量与原始产量相比提高了8倍以上，达到(5.8±1.0)mg L

High-yielding strains of endomycin and their fermentation technology and Application

The invention discloses a high-yield strain of gibberellin and its fermentation process and application. The high-yielding strain is Streptomyces sp. CB03234_R_16, which was deposited in the China Typical Culture Preservation Center on September 30, 2017 with the storage number CCTCC M 2017556. In the invention, through the evolution of the original strain CB03234 which produces active Tianzhiming based on chemical mutagenesis and ribosome engineering, a high-yield strain CB03234_R_16 is finally screened, and the fermentation yield of Tianzhiming (TNM A) is increased by more than 8 times compared with the original yield, reaching (5.8 +1.0) mg L.

【技术实现步骤摘要】
天赐霉素的高产菌株及其发酵工艺和应用
本专利技术涉及一种天赐霉素的高产菌株及其发酵工艺和应用，属于生物制药

技术介绍
面对原创新药研发投入成本高，失败率高的研发困境，如何有效加快新药研发的进程受到广泛关注。1980年至今，79％抗肿瘤药物是基于天然产物(J.Nat.Prod.2012,75,311.)，天然产物已被证明是现代药物的重要来源，尤其是抗肿瘤药物的重要来源。而其中烯二炔天然产物具有卓越的抗肿瘤活性，成药率高等优点，迄今为止已发现11个烯二炔化合物的结构，依据结构主要分为九元环和十元环，目前临床使用的有九元环烯二炔新制癌菌素，应用于肝癌的治疗。卡奇霉素已作为新一代抗体偶联药物的弹头，对抗肿瘤领域的靶向治疗产生了深远影响。2017年CD33，CD22与卡奇霉素的抗体偶联药物先后在欧洲及美国FDA批准上市(Drugs.2017.doi:10.1007/s40265-017-0802-5.)，我国开发的以力达霉素为弹头的偶联化合物目前正在临床二期实验中。烯二炔类化合物特征结构为共轭炔-烯-炔的环状结构，具有优越的抗肿瘤活性(Bioorg.Med.Chem.Lett.2015,25,9)。烯二炔类天然产物抗肿瘤的具体机制如下，其烯二炔环状结构通过Bergman或Myers-Saito重排，芳构化后形成的苯环双自由基可以进入DNA小沟，通过夺取DNA脱氧核糖上的氢离子后形成的自由基与分子氧反应，引起DNA的断裂，达到抗肿瘤的目的(Science.2002,297,1170)。天赐霉素(TiancimycinA，TNMA)是2016年从链霉菌属CB03234的发酵产物中分离发现的十元环的烯二炔类的抗肿瘤抗生素。结构与Uncialamycin，Dynemicin比较类似，但抗肿瘤活性较其更优越，具体见图1。天赐霉素A与UCM对于乳腺癌细胞(MDA-MB-468,MDA-MB-231,SKBR-3,KPL-4,BT474,DYT2)，黑色素瘤细胞(M14，SK-MEL-5)，非小细胞肺癌细胞NCI-H226，神经中枢细胞(SF-295,SF-539)的均有抑制作用，并测定其IC50值均达到nM级别。此外，AP-3，AFP是FDA批准进入临床使用的抗体偶联药物，天赐霉素A较二者针对于乳腺癌细胞SKBR-3的抗肿瘤作用，起效更迅速(8h内)，且对于癌细胞的杀死率更为彻底。鉴于烯二炔类化合物其优越的抗肿瘤活性，复杂的分子结构，超高的成药率，新发现的烯二炔类化合物不但有极大希望成为新一代抗体偶联药物的先导化合物，而且将对天然药化领域及抗肿瘤领域的起到极大推动作用。天赐霉素A复杂的分子结构使得通过传统的化学全合成方法来获取其相关衍生物的过程及其繁琐且效率十分低下，相关的烯二炔化合物产量低下(JAntibiot.1991,44,1300,OrganicLett.2005,23,5233)，Uncialamycin(UCM)，Dynemicin发现时均是产量较低(分别为～0.02mgL-1，～0.1mgL-1)，无法满足临床研究的需要和工业化生产的应用(见图1)。微生物发酵能够更好地获得该化合物，但是，原始菌株CB03234中的天赐霉素A发酵产率极低,约～0.5mgL-1，要推动后期的抗癌活性分析、作用机理等临床前期以及新药开发研究，就必需获得足量天赐霉素A。通过相关的遗传学改造，获得高产菌株，将此类化合物产量提升至～20mgL-1(工业化产量)，将是对于该化合物的临床应用奠定良好基础。因此，进一步获得稳定的天赐霉素A高产菌株无论是从现阶段研究的需要，还是将来工业化应用的需求，都迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是，提高链霉菌发酵合成天赐霉素A的产量，使天赐霉素A的工业化应用成为可能。针对以上现有技术的不足，本专利技术提供了一种新型活性天赐霉素A的高产菌株。该高产菌株为一株链霉菌，该链霉菌为Streptomycessp.CB03234-R-16，已于2017年9月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2017556。本专利技术还提供上述链霉菌在制备天赐霉素A及其衍生物方面的应用，所述天赐霉素A的化学式为：本专利技术中，如无特别说明，天赐霉素、天赐霉素A、天赐米星、TiancimycinA、TNMA均表示同一种发酵产物。本专利技术进一步提供所述链霉菌的发酵工艺，在发酵过程中，控制发酵液的pH值为6-8，溶氧为10％-70％，优选溶氧为20％-60％。优选地，控制发酵液的pH值为6.5-7.5。优选地，在发酵过程中，当发酵液的pH值上升至6.8以上时，优选控制pH值不超过7.2，向发酵液中添加酸，如盐酸、硫酸或其混合酸降低pH。盐酸优选0.5M以下的浓度，如0.2-0.3M。优选地，以可溶性淀粉为碳源，以棉籽粉为氮源。优选地，发酵培养基中碳源的浓度为8-50g/L；氮源的浓度为4-30g/L。优选碳源的浓度为30-50g/L；氮源的浓度为10-30g/L。优选地，每升发酵培养基中含，每升发酵培养基中含可溶性淀粉8～50g，棉籽粉4～30g，CuSO40.1～0.3g，NaI5～25mg，CaCO32～10g，发酵培养基的pH值为6.5～7.5。优选地，发酵温度设为常温即可(如22-33℃)，发酵时间根据发酵的规模的不同有所变化，一般不超过13天，优选为6-10天。优选地，先将所述链霉菌在25℃～32℃、200rpm～250rpm恒温摇床培养24h～50h；然后接种于生产培养基中，在25℃～32℃、200rpm～250rpm恒温摇床培养6～10天。本专利技术的菌株是通过对产生活性天赐霉素A(天赐米星)的原始菌种CB03234进行基于化学诱变和核糖体工程的菌种进化，最终筛选而得的菌株。并优化发酵培养基，其发酵产率达(22.5±3.1)mgL-1，在此基础上，在15L发酵罐中通过对转速、pH值控制及溶氧等调控手段来调试和建立放大规模的天赐霉素A微生物发酵制备工艺，其发酵产率最终达到(13±1)mgL-1。制备上述菌株的具体步骤如下：1)链霉菌属CB03234化学/核糖体工程双重诱变及筛选；2)链霉菌属CB03234-R-16的发酵培养基的优化；3)链霉菌属CB03234-R-16在15L发酵罐中通过对转速、pH值控制及溶氧等调控手段来调试和建立放大规模的天赐霉素A微生物发酵制备工艺；本专利技术通过对产生活性天赐霉素(天赐米星)的原始菌种CB03234进行基于化学诱变和核糖体工程的菌种进化，最终筛选获得一株高产菌株CB03234-R-16，其天赐霉素(TNMA)的发酵产量与原始产量相比提高了8倍以上，达到(5.8±1.0)mgL-1，经过相关发酵工艺的优化，摇瓶(250mL)产量最终达到(22.5±3.1)mgL-1，约40倍提高，15L发酵罐产量达到(13±1)mgL-1。该菌株具备工业化生产天赐霉素A的潜力。保藏证明菌种名称：链霉菌CB03234-R-16；菌种的拉丁文属名：Streptomycessp.；保藏编号：CCTCCNo.：M2017556；保藏日期：2017年9月30日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国武汉，武汉大学。附图说明图1为现有技术中烯二炔类化合物的结构及其产量。图2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株链霉菌，其特征在于，该链霉菌为Streptomyces sp.CB03234‑R‑16，已于2017年9月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2017556。

【技术特征摘要】
1.一株链霉菌，其特征在于，该链霉菌为Streptomycessp.CB03234-R-16，已于2017年9月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2017556。2.权利要求1所述的链霉菌在制备天赐霉素A及其衍生物方面的应用，所述天赐霉素A的化学式为：3.一种如权利要求1所述的链霉菌的发酵工艺，其特征在于，在发酵过程中，控制发酵液的pH值为6-8，溶氧为10％-70％。4.如权利要求3所述的发酵工艺，其特征在于，在发酵过程中，当发酵液的pH值上升至6.8以上时，向发酵液中添加酸。5.如权利要求3所述的发酵工艺，其特征在于，以可溶性淀粉和/或玉米粉...

【专利技术属性】
技术研发人员：段燕文，沈奔，黄勇，朱湘成，刘玲，潘建，
申请(专利权)人：长沙天赐生物医药科技有限公司，长沙慈航药物研究所有限公司，哈药慈航制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43